Лампа н 4: Топ-10 лучших ламп H4 для автомобиля — Рейтинг 2020 года

Leave a comment

Содержание

Тест ламп Н4 головного света для вашего автомобиля

Головной свет важен в каждой машине, особенно если он хороший. Написать обзор меня вынудила необходимость подбора ламп для вазовской классики. Моя первая машина была «шоха» ваз 2106, которая потом перешла отцу. Вот уже 10 лет он с ней никак не расстанется, следит, чинит и лелеет. Весна пришла. Настало время подготовки к новому сезону. Как назло невовремя перегорела одна из ламп в передних фарах. Менять надо обе. Я всегда меняю их парой, чтоб потом не обидно было за вновь перегоревшую лампочку. Жалеть и экономить на этом нет смысла. Это расходники. Не заменишь вовремя, себе дороже выходит. К сожалению с возрастом это не все понимают. И потом покупают в магазине вот это.

Такую вот фигню хотел поставить батяня себе в передние фары. Хорошо, что вовремя остановил. И вот почему.

Перед установкой, какая бы лампа ни была, я всегда их проверяю. У меня самого в запасе Н4 ламп не было. Я отправился в магазин AutoAll за покупками.

Приятели, что пользуются классикой из недорогих рекомендовали MegaPower. Я купил их, и среди прочего еще какие-то всепогодные с жутким названием Monster. Сам всегда пользовался Narva, Osram, Philips. Последние два экземпляра оказались дороговаты для моего бати. Но в другом магазине заказал для сравнения Osram, Narva, ClearLight. Какие лампы ставить для меня в общем проблем нет. Некоторые думают, что дешевые сойдут. В отношении качества, можно легко нарваться на подделку. У меня такое было. Надо покупать в проверенных местах.

Я решил испытать все эти лампы перед тем, как выбрать нужный вариант для головного света. Может кому-нибудь будет полезно то, что написал.

Начнем с того, что каждый водитель испытывает лампы головного света на своей шкуре. Из китайского светодиодного ширпотреба мало хороших вариантов, да и дороговаты они. Производитель часто обещает золотые горы, а на деле получается пшик. Собственный опыт говорит, что не люмены на коробке изготовителя и не световая температура спасает, а собственные ощущения. Я полагался как всегда именно на свои ощущения и опыт. Так что если что не так сделал, то напишите об этом в комментах. Интересно будет почитать и кто какие лапмы ставит. Так что пишите. Все мы автомобилисты и должны помогать друг другу.

Для сравнения выбрал несколько разновидностей ламп. Сформировал что-то вроде таблицы и с обещаниями от производителей.

Тест лапм проводил в отдельной комнате при полной темноте, лампа от стены на расстояянии трех метров. Конечно надо соблюдать минимальные требования для света. Для водителей важно, чтобы свет был достойным. Для этого нужен хороший рассеиватель. Поэтому я оптику использовал штатную от ваз 2106.

Проводил тест ламп в режимах ближнего и дальнего света. В принципе рассеивание света, интенсивность и яркость дают представление о том, как лампа будет освещать дорогу. Естественно, никакой другой аппарат по чувствительности, в этом случае, не может сравниться со зрением человека и передать все ощущения, цветовой спектр, интенсивность и концентрацию светового потока.

Так что приведенные мной данные могут быть лишь условными. Они показывают общую картину и не являются панацеей или руководством к действию. Лапмы решено было выбрать исходя из одинаковых характеристик по мощности. Я всегда брал поярче, чтобы с запасом. Но это дело вкуса. Для сравнения решено было также приобрести пару экземпляров мощностью поменьше.

Начнем с Super Light. Фотографию см выше. Не знаю, кто дал ей такое название, но для продаж для не особо разбирающихся это название подойдет. Свет в них как раз не супер. Ближний свет не особо хороший, но в норму должен вписываться.

Свет ближний

А вот дальний все же слабоват. См. дальний свет.

Мощность вроде позволяет направлять яркий пучек света, но по сравнению с аналогами он не тянет на хорошую оценку. Свет не особо впечатляет и по ощущениям явно не дотягивает для такой мощности лампы.

Следующий номер программы — Narva.

У нее отличные показатели ближнего света. Реальный ближний свет четко виден.

Пучок света концентрированный, яркий.

Пучек ближнего света концентриванный, с хорошей интенсивностью. Дальний свет превосходен. См. дальний свет.

Для дальнейшего сравнения берем MegaPower.

Ближний свет показывает неплохие результаты. См. ближний свет.

Пучек достаточно концентрированный, отчетливый, интенсивность хорошая, яркость на уровне. Дальний свет также хорош.

Рассеивание света превосходное. По ощущениям яркости вполне достаточно для освещения дороги далеко впереди.

Следующий пункт программы — всепогодные лампы Monster.

Если честно, то сначала доверия эти лампы сначала не вызвали. Но тест развеял сомнения. См. ближний свет.

Пучек света впечатляет — направленный, яркий, с неплохой фокусировкой, постоянной интенсивностью. Свет желтоватый, а при включении дальнего света становится более белым. См. дальний.

Результат по эффективности сравним с предыдущими двумя экземплярами.

Следующим пунктом программы я взял Osram. Это лампы качественно другого ценового сегмента. Очень кусачая цена, но отличный результат и по эффективности и по долговечности.

На упаковке вроде бы сказано, что они только для ралли. Но сравнительные технические характеристики были в том же диапазоне, поэтому для сравнения впишутся, хотя цена ощутимо выше всех аналогов. См. ближний.

Пучек света ощутимо ярче всех аналогов. Свет концентрированный, очень яркий, по характеристикам превоходит обычный ближний свет. Интенсивность постоянная, фокус очень хороший. То же можно сказать о дальнем свете. См. дальний свет.

Свет ощутимо эффективнее рассеивается даже по сторонам. Подумалось, что это может быть из-за характеритик ииспользуемой нити в самой лампе. Результат сразу превосходит ожидания. Но надо иметь в виду, что такие лампы могут ослеплять едущих навстречу вам водителей. Поэтому лучше выбрать что-то в качестве компромиссного варианта. Или же желание может пересилить, зато свет на уровне выше других.

Следующие экземпляры Clearlight 6000K и 4300K не совсем вписываются в сравнения, так как их мощноть на треть ниже, но зато светить вроде бы должны не хуже, как обещает производитель. Но обещать не значит сделать.

См. ближний свет Clearlight 6000K.

Ксенон-эффект, как заявлено, вроде бы виден в пучке света, концентрация отличная. Сама интенсивность — согласно норме, пучок четкий, свет отличный, даже чуть выше ожиданий. Дальний свет — очень неплохой по яркости для такой мощности ламп. См. дальний свет Clearlight 6000K.

Рассеивание света в лампах Clearlight 6000K вполне устраивает, так как свет в спектре стремится к белому. Я уж не знаю, насколько это чувствительно для кого-либо, но по качеству светового потока, это, пожалуй, очень неплохой результат. Я по результату так и не смог их отличить от ламп ClearLight 4300K.

Визуально эффект почти одинаковый, но это только по ощущениям. Как лампа будет вести себя на дороге — разговор особый. См ближний свет Clearlight 4300K.

Тоже самое относится и к дальнему свету. Рассеивается хорошо, яркость очень неплохая для такой мощности. См. дальний свет ClearLight 4300K.

Что получаем в результате. Выбор за покупателем. Хотите белый свет, тогда ClearLight вам подойдет, более яркие впечатления даст Osram. А для юзеров обычных ламп — Narva и MegaPower. Вполне вписывается сюда Monster, который приятно удивил своими характеристиками. По долговечности эксплуатации вроде всегда говорят о более известных аналогах. Но это не факт. Бывают и неплохие лампы среди недорогих. Будем испытывать Narva и Megapower. Не знаю, сколько прослужат. Еще на тест отдам Monster и ClearLight своим приятелям. Покатаются, потом расскажут о них больше.

Что еще мне кажется важным сказать. Всегда стоит помнить о том. что ощущения очень субъективны. Вероятность ошибки возрастает, если не учтены погодные условия. Имеют значение и индивидуальные особенности водителя, его зрение, например.

Также важна правильная регулировка головного ближнего и дальнего света, возможность использования противотуманных и дополнительных фар дальнего света вместе с основной оптикой. Могут влиять и некоторые другие факторы. Главное не переоценить себя и уважать других водителей, так как вы не одни на дороге. Правильный выбор это полдела. Остальное зависит от выполнения стандартов и правил, которые также обязательны для всех. Помните, что правильный выбор ламп определяет основы вашей безопасности и безопасности других водителей — участников дорожного движения. Если проигнорировать вопрос качества и цены, случится вот что. См. лапма SuperLight сразу после использования.

Перегорела сразу после установки в течение нескольких секунд. Вот такой неудачный оказался выбор.

Что сказать вцелом по итогам сравнительного теста.

Установка ламп велась, как и полагается в соответствии с инструкцией. Не касаясь колбы, установку нужно проводить с использованием средств индивидуальной защиты. Не на всех упаковках, кстати, об этом сказано. Отчетливо написано на упаковке Narva, что установку производить в очках с защитой, перчатках.

Как ведут себя лампы MegaPower среди всех остальных. На мой взгляд, неплохо смотрятся. А вот как поведут себя они на дороге, пока неизвестно. На первый взгляд, яркие, мощные, хорошо рассеивают свет, интенсивность на уровне. На счет срока службы трудно сказать по каждой лампе, но выше цена — лучше качество не всегда верно.

Окончательные результаты представлены в таблице.

Особую благодарность хочу выразить моему другу Андрею, который помогал мне в проведении теста и написании текста обзора. Благодарю автомагазин запчастей AutoAll за хороший выбор автоламп, хороший сервис и приемлемые цены на сайте.

Будьте вежливы друг к другу на дороге. Наша взаимопомощь — залог общей безопасности в пути.

Спасибо всем.

Ваш Сергей.

Обзор светодиодных автомобильных ламп h5 ближнего и дальнего света

Светодиодные приборы освещения широко применяются не только в быту, но и в автомобильной промышленности. Примером служат светодиодные лампы h5. Они используются для ближнего и дальнего света. Автолампы h5 пришли на смену галогенным и ксеноновым осветительным устройствам, возглавляя рейтинг приборов освещения для фар. Добиться лучших показателей эффективности для ЛЕД-лампочекполучилось путем использования диодов в качестве источников света. Сравнение LED-приборов освещения с другими показывает еще и более высокую яркость. Производители снабдили новые диодные осветительные устройства улучшенными характеристиками.

Светодиоидные лампы Н4 используются для ближнего и дальнего света

Устройство диодной лампочки h5

В состав ЛЕД-ламп ближнего/дальнего света входят следующие элементы:

светоизлучающие диоды — 2 шт.;
радиатор алюминиевый — 1 шт.;
вентилятор — 1 шт.

Диоидная лампа состоит из двух диоидов: для ближнего и дальнего света

Один из светодиодов создает ближний свет, а второй — дальний. Кристалл каждого из диодов имеет длину, равную нити накала. Благодаря этому свет в фары распределяется так же, как и в лампочках накаливания. Функцию охлаждения выполняют вентилятор и радиатор. Последний изготовлен из алюминия, который обеспечивает хорошую теплоотдачу. Но диодные лампы h5 не подвержены перегреву. Температура, до которой они нагреваются, намного меньше, чем у лампочек накаливания. Стекла фар-ламп h5 отличаются тем, что в летнее время меньше потеют, а в зимнее — на них образуется пониженное количество льда.

LED-лампы комплектуются электронным блоком управления. Его основные функции:

Управляет работой стабилизатора напряжения.
Переключает режимы ближнего/дальнего света.
Отвечает за работу вентилятора.

С помощью стабилизатора сглаживаются скачки напряжения в автомобильной сети. Охлаждение электронного блока управления обеспечивает вентилятор.

Принцип работы светодиодных ламп h5

Дальнее освещение LED h5 функционирует как прожектор. Расположение спирали лампочки совпадает с фокусом параболического рефлектора. После включения спираль работает генератором увеличенного светового потока, параллельного дороге. В этом процессе излучение увеличивают с помощью использования поверхности отражающего элемента. Лампа ближнего света для работы применяет вторую спираль, расположенную перед фокусом. Ее снизу прикрывает небольшой экран. При изготовлении лампы ближнего света экрану придается специальная конфигурация. Из-за такой конструкции при включении часть потока отсеивается, оставляя световое пятно нужной формы. При этом задействована верхняя часть рефлектора. Направление светового потока идет вниз. Переключаются лампочки светодиодныеh5 за счет перемещения колбы в разные положения.

Параметры ЛЕД-ламп h5

Работу светодиодных лампочек ближнего/дальнего света описывают технические характеристики:

Чтобы выбрать диоидные лампы, нужно знать все технические параметры

Мощность, которую они потребляют. Диодные лампочки головного света расходуют меньше электроэнергии, чем галогенные и ксенон.
Напряжение ЛЕД-ламп составляет 12 В или 24 В.
Марка светоизлучающих диодов.
Световой поток. Он измеряется в люменах (Лм) и равен количеству энергии, которую излучают за 1 секунду автомобильные лампы.
Температура нагрева. Диодные лампочки в основном нагреваются примерно до 60–80 °С.
IP корпуса. Данный показатель характеризует степень защиты от внешних факторов: влаги и пыли.
Цветовая температура. Параметр соответствует цвету излучения.
Материал корпуса. При изготовлении производители используют алюминий или его сплав.
Наличие обманки в блоке питания. Ее функция — нагружать систему дополнительно, чтобы увеличить низкий ток светоизлучающих диодов до минимального значения. В противном случае бортовой компьютер будет считать автомобильные светодиодные лампы нерабочими и отключит питание, поступающее на них.
Срок эксплуатации.
Эффективность. Данная величина показывает, сколько люменов светового потока выдают светодиодные лампы для автомобиля, затратив мощность 1 Вт.

Оценка работы осветительного устройства производится с учетом всех параметров. Для того чтобы осуществить выбор, необходимо определиться со значениями технических характеристик.

Сравнение диодных ламп h5 с галогенными и ксеноновыми

Сопоставляя технические характеристики разных автомобильных приборов освещения, можно увидеть, какие лучше.

Сравнение света диоидов и ксенона

Мощность. У галогеновых ламп она примерно 60 Вт, у ксеноновых 35 Вт, а у ЛЕД — 20–40 Вт. По параметру энергопотребления лучшие лампы h5 — это светодиодные.
Световой поток. Галогенные осветительные приборы излучают 1200–1500 Лм. У ксенона эта характеристика может достигать 3000 Лм. Светодиодные лампыН4 генерируют световой поток 4000 Лм. Т.е. они светят ярче, чем ксенон и галоген.
Эффективность. Галогеновые лампы h5 выдают 30 Лм/Вт, ксеноновые — 85 Лм/Вт, а диодные — 100 Лм/Вт. При потреблении одинакового количества электроэнергии самые яркие оказываются LED-лампочки.
Цветовая температура. Галогенные лампы излучают при 2800 К (2527 °С), что соответствует теплому белому свету. Ксенон — при 4300–5000 К (4027–4727 °С), получаемый свет воспринимается как дневной. Тест ламп Н4 показывает, что их цветовая температура — 5000–6000 К (4727–5727°С). Они излучают холодный белый свет.
Срок эксплуатации. Для ламп важно не только то, как они светят, но и время их службы. Галогеновые лампы для авто проработают 500 часов, ксенон — 3 тысячи часов, а светодиодные — 30 тысяч часов.

Если сравнивать все параметры работы автоламп h5, самые лучшие из них — светодиодные осветительные устройства.

Как выбрать светодиодные лампочки h5

Для того чтобы определиться, какие лампы лучше использовать, рассмотрим несколько вариантов. Обзор диодных приборов освещения h5:

При выборе светодиоидных ламп обратите внимание на мощность, степень защиты и спектр света

Автомобильные LED-лампочки CL7 h5 premium. В них установлены диоды Филипс. ЛЕД-автолампочки h5 потребляют мощность 25 Вт. Это намного меньше, чем галогеновые. Цветовая температура равна 4800 К, что соответствует дневному освещению. Обновленный комплект светодиодных ламп CL7 h5 отличается увеличенной на 15% яркостью по сравнению с предыдущей серией. Световой поток на одну лампу составляет 1700–1900 Лм. Cl7 h5 работают от напряжения 9–32 В. Светодиодные лампочки CL7 h5 имеют срок эксплуатации 5 лет. При этом максимальная температура, до которой они могут нагреться, составляет 110°С. Это получше, чем у аналогичных галогеновых осветительных устройств, которые нагреваются свыше 200°C.
Следующий вариант — диодные лампочки h5 седьмого поколения G7. Тестирования показывают, что световой поток у них достигает 4000 Лм. Отличительная черта h5 G7 — пассивная система охлаждения. Вдобавок к этому, они имеют хорошие энергетические характеристики, расходуя мощность 25 Вт. Рабочее напряжение для h5 G7 составляет 12–24 В. Цветовая температура равняется 6500 К, поэтому лампочки G7 могут выбирать любители холодного белого света. ЛЕД-лампы седьмого поколения обладают высокой эффективностью — 160 Лм/Вт. Качественная защита от внешних условий обеспечивается усиленным корпусом с IP 65.
Лампы h5 с повышенной светоотдачей. Одна лампа, потребляя мощность 30 Вт, излучает световой поток 3200 lm. Работает от напряжения 8–32 В. Super LEDизготовлена на основе светодиодов Osram. Цветовая температура лампочек для авто h5 повышенной яркости равна 6500 К, что соответствует холодному белому свету. Супер ЛЕД работают 50 тысяч часов.
Автолампы h5 на 12V 60/55W. Как видно из названия, данное устройство работает от напряжения 12 В, потребляемая мощность может быть двух вариантов:55 Вт или 60 Вт. Лампа h5 12V 60/55W отличается увеличенным световым потоком. Автолампа h5 на 12V 60/55W изготавливается на основе диодов Филипс.

Из приведенного списка можно выбрать диодные устройства освещения ближнего/дальнего света в зависимости от параметров.

Установка LED-ламп h5

После того как сделан выбор LED-лампочек, следует их монтаж. Установка светодиодных ламп проводится в несколько этапов:

Прежде чем установить новую диодную лампочку h5, потребуется изъять старую.
Далее ставим ЛЕД-лампочку Н4.
Затем устанавливаем и закрепляем электронный блок управления.
Далее требуется поставить вентилятор на лампочку.
Лампочка h5 и вентилятор соединяются с электронным блоком управления.
Затем блок управления подключается к разъему электропроводки.

После того как правильно все сделали, автомобиль с установленными светодиодными лампочками готов освещать дорогу.

Лампа h5 куда подходит

Всем привет.
Сегодня расскажу немного про лампы.

Поскольку работа световых приборов напрямую влияет на безопасность движения, производители обязаны обеспечивать их соответствие требованиям государственных и международных стандартов. В данном случае имеются в виду «Правила Европейской Экономической Комиссии ООН» №37, которые являются базовым европейским стандартом по безопасности средств автомобильного транспорта. Подтверждение соответствия правилам называется омологацией. Если деталь или узел омологированы, то на них в кружке стоит знак официального утверждения E и цифра, обозначающая код страны. Узлы и детали, не соответствующие данному стандарту запрещены к применению в Европе. Номер страны, утвердившей соответствие данного прибора, ставят в круге рядом с буквой «Е». Например: 1-Германия, 2 — Франция, 5 — Швеция, 22 – Россия.

Важнейший элемент световых приборов — лампы являются самыми унифицированными деталями в мировом автомобилестроении.

В отличие от бытовых электроламп, автомобильные работают в условиях тряски и вибрации и, соответственно, имеют более прочные спирали (в них использован вольфрам другой марки). Цоколи с круглой дюймовой резьбой большая редкость на лампах для подвижной техники. Здесь применяются подпружиненные патроны или зажимы, исключающие выворачивание или разбалтывание крепления лампы.

Такой принцип фиксации лампы в патроне стал широко применятся в автомобилестроении, подвергаясь лишь некоторым видоизменениям.

имеют жесткий допуск на расположение спирали относительно фланца, а значит, позволяют размещать ее точно в фокусе отражателя оптического элемента или на нужном расстоянии от него. Если фланцевая лампа предназначена для фары головного света или прожектора, то ее спираль дальнего света либо компактно свернута, как бы приближаясь к идеальному точечному источнику света, либо растянута вдоль оптической оси отражателя (лампа h2, H7). Если же лампа предназначена для противотуманных фар, то спираль может быть перпендикулярна оптической оси (лампа Н3).

Лампы R2 относятся к старому поколению световых приборов и применяются в двух фарных системах освещения. Их применение ограничивается старым парком автомобилей и сельхозтехники.

Лампы Н1 и Н7 применяются в четырех фарных системах автомобиля. При этом если раньше лампа Н1 использовалась, как на ближний так и на дальний свет, то с появлением лампы Н7 её применение ограничилось в оптике дальним светом или противотуманными фарами. Это связано с тем, что лампа Н7 разработаны для оптики последнего поколения и наряду с высокими эксплуатационными характеристиками (низкая температура цоколя и менее ослепительный свет) имеет на 20% большую яркость по сравнению с Н1 лампой. Лампы категории Н4 наиболее популярны и востребованы автосборочными заводами. Простата установки, регулировки и замены является несомненным преимуществом для автомобилей эконом класса. Однако самый главный недостаток это низкая световая отдача для нити ближнего света всего 1000 Лм. Для сравнения световая отдача лампы Н7 – 1500 Лм.
Штифтовые лампы.

Лампы HB3 и HB4 наряду с лампами Н8, H9 и h21 используются как отдельно, так и совместно с газоразрядными ксеноново-металлогалогенными лампами. Комбинирование вариантов освещения дает максимально возможный уровень и качество света.

НВ1 и НВ5 лампы применяются только на американских автомобилях. НВ4 в качестве головных ламп на ближний свет, а НВ3 на дальний свет. Применение лампы Н8 ограничивается для оптики ближнего и противотуманного света, оптимальный выбор для фар, с требованиями низкого потребления электроэнергии и особыми температурными условиями по нагреванию оптического элемента. Лампы Н9 применяются исключительно на дальнем свете там где надо мощный световой поток. Применение для ближнего света допускается только при наличии автоматического корректора фар. Н11 лампа нашла применение во всех направлениях развития оптических элементов. Идеально сбалансированная по конструкторским особенностям лампа имеет самый большой срок службы до 2000 часов.
Цоколей автомобильных ламп по IEC-EN 60061-1

Лампы головного света

Отличаются лампы головного освещения не только принципом действия. В зависимости от назначения они имеют различную конструкцию цоколя, колбы и спиралей. Чтобы не было путаницы, Правилами ЕЭК ООН, которые регламентируют требования к световым приборам автомобилей, установлена классификация ламп по типам: h2, h3, h4, h5, H7, а также HB1, HB2, HB3, HB4, D1, D2 (последней маркируются газоразрядные лампы). Лампы h2 предназначены для фар дальнего света в четырехфарной системе головного освещения (например, BMW, ВАЗ 2106), а изредка применяются и в противотуманных фарах.

Лампы h4 с так называемым проводом-хвостиком используются только в противотуманных фарах, а h3 встречаются значительно реже — обычно в дополнительной оптике Hella и в противотуманных фарах некоторых французских авто. В традиционной двухфарной европейской системе освещения типа CR международными нормами предусмотрено применение двухнитевой лампы h5 и однонитевой H7. Лампы H7 появились не так давно и применяются в основном на автомобилях после 1995 года выпуска, которые оборудованы так называемыми фарами свободной формы.

Лампы, маркирующиеся как HB — 1, 2, 3, 4 … свидетельствуют об их соответствии американским стандартам. Устанавливаются они, как правило, на американские и некоторые японские автомобили. Главная особенность этих ламп — необычная конструкция цоколя. HB1 и HB2 — это двухнитевые фары для американских машин, HB3 и HB4 — однонитевые, чаще встречаются на японских автомобилях. А главное отличие — в Европе с 1957 года принято асимметричное светораспределение с лучшим освещением «пассажирской» обочины и с четкой светотеневой границей. Но в Америке использование фар с границей света и тени разрешили только с 1997 года. Разрешили, но не потребовали! Свет «американских» фар распределяется почти симметрично, вовсю ослепляя встречных водителей. К тому же американцы регулируют фары только по вертикали. А еще в США и Канаде отсутствует единый порядок сертификации приборов освещения.

Многие производители наряду с простыми галогенными выпускают лампы с улучшенными характеристиками. Например:
всесезонные:

Из курса физики известно, что свет с большой длиной волны (от синего до красного) имеет и большую проникающую способность (явление дифракции световых волн). Именно поэтому запрещающий сигнал светофоров выбран красным – этот цвет виден дальше всех. Для глаза человека наибольшая разрешающая способность (различение мелких деталей) достигается при синем свете. Однако красный и синий цвета оказывают сильно раздражающее действие на наше зрение и глаза быстро устают. К тому же получить мощные источники красного и синего света сложно, да и не нужно – сама природа подсказывает компромисс: оптимальный цвет для глаз – желтый, он ближе всего к спектру солнечного света.

Поэтому большинство противотуманных фар имеют желтый или так называемый «янтарный» свет – он на 10-15% меньше рассеивается на частицах тумана, снега, дождя, чем белый, и дает достаточную освещенность дороги. Желтый свет лучше переносится водителями встречного транспорта, не вызывая у них эффекта «ослепления», а тому, кто за рулем, собственные желтые фары помогают избежать зрительной усталости при длительных поездках ночью. Но в принципе выбор цвета противотуманного света – дело вкуса водителя.

«Всепогодки» отличаются большей эффективностью при плохих погодных условиях – в туман, дождь, снегопад. Капельки влаги, которые висят в воздухе, подсвеченные лучами фар, образуют обширное свечение, на фоне которого водителю трудно выделять окружающие объекты. В сочетании с уменьшением длины луча фар, вызванного рассеиванием, это снижает видимость.

Лампы данной группы отличаются излучением желтого спектра, которое дает более контрастное в описанных условиях освещение. Благодаря иной длине волны, отличной от белого, световой поток желтого цвета лучше пробивает водяную взвесь в атмосфере. Поэтому эффект «белой завесы» перед автомобилем снижается. Конструктивные особенности всепогодных ламп – увеличенная на 10 – 30% светоотдача и особое многослойное покрытие колбы – желтого или желто-фиолетового оттенка.

Всепогодные или, как их еще называют, всесезонные лампочки имеет смысл устанавливать тем, кто целый год много ездит в темное время суток, особенно в регионах с сырым климатом.

Производители гарантируют их удвоенную долговечность, рекомендуя эту продукцию профессионалам, чьи машины не простаивают ни днем, ни ночью. Специальный состав газовой смеси-наполнителя и особая технология изготовления нити накаливания продлевают срок их службы. Кроме того, комплекс технологических мер обеспечивает большую вибростойкость этих источников света.

у Philips, Narva и Osram обозначаются одинаково — Long Life,

— с увеличенной на 30% и 50% светоотдачей:

Несколько лет назад появились галогенные лампы, которые при стандартной для своего типа потребляемой мощности 60/55 Вт имеют увеличенную на 30% светоотдачу. Сегодня их предлагают по той же цене, что и обычные. Принципиально конструкция улучшенных приборов не отличается от обычных. Большая эффективность достигается за счет увеличения температуры нити накала, а ее ускоренное выгорание исключается применением в колбе газовой смеси особого состава.

Последняя новинка в этой группе – лампы с 50-процентной прибавкой яркости. На практике это означает увеличение длины луча на 5 – 10 метров, что весьма заметно даже «на глаз». Соответственно, водитель получает возможность раньше заметить препятствие и принять соответствующие меры.

Лампы повышенной яркости можно рекомендовать владельцам старых автомобилей, в которых оптика утратила первоначальные прозрачность стекла и блеск отражателя.

Philips: Premium (+30%), VisionPlus (+50%)

Osram: Super (+30%), Silverstar (+50%)

Narva Range Power (RP) (+30%), Range Power 50 (RP50) (+50%)

— излучающие свет с голубым оттенком:

Мечта каждого автомобилиста – ездить ночью, как днем. Желая помочь в этом водителям, многие фирмы наладили производство ламп с ярко выраженным белым спектром свечения. В рыночном названии некоторых из них присутствует слово «голубой», хотя на самом деле их лучи все-таки белые.

Многие ошибочно называют такой свет ксеноновым. По этой причине лампы «дневного» света получили сегодня широкое распространение, тем более что устанавливают их, в обычные фары, предназначенные для галогенных ламп. По большому счету, от обычных ламп источники света этой группы отличает только спектр излучения, который обеспечивается соответствующим цветом стекла колбы или ее участка.

Philips: Blue Vision

Osram: Cool Blue

Narva: Range Power Blue (RPB)

Голубое напыление ламп Blue Vision и Cool Blue или Range Power Blue отсекает выход из лампы света в красном, желтом и других спектрах, обеспечивая освещение идеально белым светом с голубым оттенком. Такое освещение очень эффективно при длительных ночных поездках, поскольку глаза от него практически не устают. Кроме того, голубой оттенок позволяет сохранять световое пятно во время движения по городским улицам, освещаемым светом фонарей в желтом спектре.

Обозначение автоламп по европейскому стандарту ЕСЕ R37.

Т миниатюрная цокольная лампа ( T 4 W )
R лампа с 15-мм цоколем и колбой диаметром до 19мм ( R 5 W )
P лампа с 15-мм цоколем и колбой диаметром до 26,5мм( P 21 W )
W после числа обозначает мощность(60/55 W ), а если ее нет – то число обозначает номер модели
W в начале маркировки означает, что лампа с стеклянным цоколем ( W 5 W )
Н указывает, что галогенная( H 6 W )
Y перед числом означает, что лампа имеет оранжевый цвет колбы( PY 21 W )

Обозначение цоколей по международному стандарту IEC и DIN

P заглавная буква в начале маркировки означает, что лампа фланцевая
ВА лампа штифтовая с симметричным расположением штифтов относительно друг друга
BAY лампа штифтовая со смещением одного из штифтов по высоте
BAZ лампа штифтовая со смещением одного из штифтов по высоте и радиусу
SV лампа софитная (с двух сторон цоколь)
E лампа с резьбовым цоколем
W Лампа со стеклянным цоколем

Маркировка Галогенных ламп.

• Производитель – компания подавшая заявку на официальное утверждение.
• Тип лампы – галогенные лампы по габаритам, цоколю, исполнению, подразделяются на типы. Бывают следующие типы галогенных ламп h2; h3; h4; h5; H7; h21; h37; HB3; HB4. В данном случае, тип лампы h5.
• Напряжение – номинальное напряжение, при котором используется данная лампа.
• Мощность – потребляемая мощность, если значение указано через дробь (Например: 60/55W) это означает что мощность основной нити (дальний свет) 65 Ватт и вспомогательной нити (ближний свет) 55Ватт.
• Страна утверждения – указан код страны выдавшей официальное утверждение. Все коды указаны ниже. В нашем примере это E1-Германия.

Применяемость некоторых автомобильных ламп.
Перёд:

И в конце немного про лампы для тюнинга :

Одна из последних разработок компании «Philips», это лампы «Silvervision», по другому эти лампы можно еще назвать «невидимыми». Колба такой лампы покрыта серебристым напылением, лампочка сливается по цвету с отражателем, что позволяет ей быть незаметной в современной фаре. Выпускаются не только лампы головного света «Silvervision», но и лампочки для обозначения поворотов, которые по определению должны быть желтыми и светить желтым светом, называются такие лампы «diadem», и как не странно они так-же имеют колбу серебристого цвета и невидимы на фоне отражателя, при этом светят они именно желтым цветом.
Еще одна интересная разработка компании «Philips», — лампы увеличенной светоотдачи на 30% (GT 130) и на 50% (GT 150) для тюнинга: «Power2Night». Современная красивая упаковка и синий колпачок на колбе, вместо традиционного черного, — это все что отличает эти лампочки от соответственно «Premium +30%» и «Vision Plus +50%».

И естественно несколько лестных слов нужно сказать о последней, своего рода уникальной, разработке компании «Philips» лампочках «Night Guide — 3 in 1», — это мультиспектровые лампы, совместившие в себе свойства трех бестселлеров: «Vision Plus +50%», «Blue Vision», «Weathervision». Свет этой лампы на дороге распределяется на три зоны: спереди – белый свет увеличенной светоотдачи на 50%, позволяющий осветить дорожное полотно на 10-20м дальше, чем обычный галоген, слева – свет с желтоватым оттенком, не слепящий встречных водителей и справа – зона дневного света с голубым оттенком, особо хорошо освещающая дорожные знаки и придорожную зону.

Колпачок покрыт палладием, хромированный цоколь
Специальное антибликовое покрытие
Улучшенная геометрия расположения нити накаливания
Новая смесь газов и соответствующее оптимальное давление
Кварцевое стекло с оптической полировкой

Новые галогенные лампы X-treme Power соответствуют нормам ECE R37.

Прими участие в гонкаx! Мощная, как пушечное ядро!
Ваш автомобиль сразу бросается в глаза.
Вам видно и Вас видно как никогда!

Лампы X-Treme Power Philips являются несомненными лидерами по яркости освещения дороги. Конкуренцию данным лампам составляют Osram Night Breaker. Положительные отзывы о Philips X-Treme Power (+80%), действительно высокое качество и надежность ламп сделало их бестселлерами на рынке

Philips X-Treme Vision

На 100% больше света.

Максимальная мощность светового потока для максимальной видимости достойна нового впечатляющего названия, так как она отражает принципиальную позицию компании Philips: просто безопасность! Сегодняшние потребители всегда в движении и стремятся к безупречному качеству и мощности светового потока для безопасности и комфорта за рулем. Технология Philips задает тон в инновациях, отвечающих нуждам самых требовательных потребителей. Просто самая мощная по световому потоку лампа из всех ламп!
Лампы Philips X-Treme Vision используют yникальную технологию, что позволило увеличить яркость на 100%. Так же увеличен срок службы, по сравнению с лампами X-Treme Power.

Новые галогенные лампы X-treme Power соответствуют нормам ECE R37.

Лампы X-Treme Vision Philips — новинка в автомобильном освещении. Яркость этих ламп увеличена на 100% по сравнению со стандартной разницей. Поставив эти лампы Вы сразу почувствуете разницу с Вашими старыми лампами.

Безопасность ламп серий WHITEBEAM III и VWHITE для фар и электрооборудования автомобиля гарантирована, так как производство этого продукта соответствует международным стандартам качества ISO.

К примеру, автолампы Които с цоколем h5 60/55W серии WhiteBeam III светит так же, как мощная h5 135/125 Ватт. При этом тепловыделение идентично стандартной лампе, поэтому можно не переживать — Ваша фара не поплавится.
h2 — 55W, освещение как 100W.
h4 — 55W, освещение как 100W.
h5 — 12V 60/55W, освещают как 125/135W.
H7 — 55W, освещение как 100W.
h21 — 55W, освещение как 100W.
HB3 (9005) — 65W, освещение как 120W.
HB4 (9006) — 55W, освещение как 110W.
При стандартном потреблении мощности лампочки Koito с красивым цветом 4200K освещают дорогу в 2 раза ярче!

Лампы Които имеют красивый бело-молочный цвет 4000-4200K — равносильный штатному ксенону

Поездки в темное время суток, какими бы опасными и некомфортными они не казались, неизбежны. Для обеспечения безопасности движения в подобных непростых условиях каждый автомобиль оснащен рядом специальных устройств, самыми важными из которых являются осветительные приборы. От их состояния и уровня оснащенности напрямую зависит качество освещения дороги и детальность обзора.

О том, какие лампы лучше всего подойдут для правильного ближнего света, и на что обратить внимание при их выборе, рассказал специалист технического центра ГК FAVORIT MOTORS Дмитрий Кульков, сервис-менеджер автоцентра KIA FAVORIT Коптево.

От чего зависит качество света фар

На сегодняшний день почти треть автомобилей оборудованы недостаточно эффективными приборами головного освещения. Основной причиной плохого светового потока является ненадлежащее техническое состояние оборудования. Основной причиной плохого светового потока является ненадлежащее техническое состояние оборудования и несоответствие направления светового потока. Но в ряде случаев для улучшения обзора дороги требуется простая замена лампочки, полировка фары и регулировка направления пучка света фар.

Как выбрать необходимую лампу?

На сегодняшний день на рынке представлен большой ассортимент ламп различных производителей. Однако среди разнообразия дорогих и доступных искусственных источников света важно разобраться, какие лампы лучше поставить в ближний свет именно вашего автомобиля. В зависимости от вида лампы могут различаться по своему функционалу.

Ксеноновые лампы гарантируют отличную видимость на дороге, в том числе и во время дождя или снегопада. Важным преимуществом таких ламп является их относительная безопасность для человеческого глаза. Свет ксенона похож на дневной естественный и, даже если вы находитесь за рулем в течение нескольких часов в темное время суток, вы не почувствуете сильную усталость. При этом заявленный срок эксплуатации ксенона составляет около 3000 часов при потребляемой мощности всего 35 Вт. Единственным недостатком ксеноновых лампочек является высокая стоимость.
Галогеновые лампы также используются для установки в фары головного света. Особенностью таких автоламп накаливания является наполнитель колбы – инертный газ. Говоря о количестве полученного светового потока, «галогенки» менее эффективны по сравнению с ксеноном, однако, цена таких ламп выгодно отличается. Кроме того, галогеновые лампы имеют богатый выбор типоразмеров и срок службы около 4000 часов.
Светодиоды также можно поставить в оптику вашего автомобиля. Лампа диодного типа обладает особенно длительным сроком эксплуатации — около 50 000 часов и низким уровнем требуемого напряжения всего 12 В. Зачастую светодиоды устанавливаются в головные фары иномарок, а также в обычные противотуманные фары. Этот вид небольших по размеру ламп прекрасно справляется с обеспечением яркого ближнего света, а также дополнительной подсветкой. Если это неоригинальные фары, предназначенные под использование светодиодов, они не обеспечивают требуемой формы светового потока. Обязательно наличие надежной теплоотводящей конструкции.

Классификация ламп

В зависимости от назначения, особой конструкции колбы, а также нитей накаливания, спиралей и цоколя все лампы головного освещения делятся на определенные типы в соответствии с требованиями к световым приборам авто ЕЭК ООН. Наиболее распространенными типами ламп являются предусмотренные международными нормами двухнитевая лампа h5 и однонитевая H7, устанавливающаяся на автомобилях, выпущенных за последние 20 лет. Оба варианта используются в общепринятой двухфарной системе освещения типа CR, принятой в Европе. Самые лучшие лампы с цоколями h5 и H7 производят такие известные компании, как Hella, Philips, Osram, IPF, IL Trade и MTF-Light.

Автолампы h5

Лампочки h5, благодаря двум нитям накаливания применяются как для ближнего, так и для дальнего света. По причине того, что современные производители предлагают множество модификаций необходимо знать характеристики лампочки h5 какие лучше всего подходят вашей системе оптики. В целом все лампы этого типа имеют стандартную мощность 60-65 Вт, режим работы на дальний или на ближний свет регулируется автоматическим выбором соответствующего электрода. После выхода закона об обязательном использовании в дневное время суток фар ближнего света, в магазинах появились лампы Н4 с увеличенным ресурсом эксплуатации. Теперь использовать такую лампу можно круглосуточно без ущерба автомобилю. На современном рынке запчастей 2018 года представлено несколько категорий автомобильных ламп h5:

Штатные лампы, которые устанавливаются на автомобиль на заводе;
Лампы с увеличенным световым потоком;
Универсальные лампы, обеспечивающие визуальный комфорт. Такие лампы способны заменить противотуманные фары;
Лампы повышенной мощности, которые используются в сочетании с дополнительным электронным оборудованием, защищающим генератор и электрическую проводку авто от перегрузки.

Автолампы H7

Сравнительно новая версия автомобильной лампы — с цоколем H7, которая обладает светопотоком повышенной яркости, усиленным благодаря включениям галогенных паров брома и йода. Нить такой лампы изготовлена из особых вольфрамовых сплавов высокой прочности. Прежде чем ставить подобную лампу в фару вашего автомобиля, проконсультируйтесь, какие лампы H7 лучше. Детальный обзор большинства галогеновых ламп h7 показывает, что все они обладают гарантировано длительным сроком службы. Отличительными особенностями ламп различных производителей являются мощность и спектр, который может варьироваться от теплого до холодного света.

Если вы планируете совершить дальнее путешествие на автомобиле, обязательно позаботьтесь об установке качественной H7 лампы дальнего света. Благодаря специальному устройству лампы, оснащенной защитным кольцом, свет ваших фар не будет слепить водителей автомобилей встречного движения. Выбирая долговечную и безопасную лампу для головного света, обязательно обращайте внимание на репутацию производителя и страну происхождения изделия. Только произведенная в соответствии со специальными техническими условиями лампа способна обеспечить оптимальную безопасность движения.

Если Вы испытываете сложности с подбором или заменой необходимой Вам лампы ближнего и дальнего света, обратитесь к специалистам технических центров ГК FAVORIT MOTORS. У официального дилера известных автомобильных брендов оригинальные лампы всегда имеются в наличии. Опытные мастера подскажут, как сделать правильный выбор и в случае необходимости оперативно заменят лампы в осветительных приборах вашего автомобиля.

Ни один водитель не планирует и не желает попасть в ДТП, тем более с тяжелыми последствиями. Тем не менее, если темно и падают осадки или держится густой туман, сбить пешехода, скатиться в кювет или столкнуться с другим автомобилем не так уж трудно. Максимально снизить риск аварии способны лампы Н4 головного света, которых существует несколько видов. Чтобы упредить неприятность, выбрать нужно лучшую, причем подходящую для каждого конкретного случая. Именно такие лампочки приведены ниже.

Лампу Н4 какой фирмы выбрать

Современный рынок насыщен многими автотоварами, в том числе и лампами, которые разделяются на множество видов. Одни из них под названием Н4 изготавливаются как новыми, так и давно известными производителями. Именно на последнее нужно обращать внимание покупателю.

Philips – хорошо известная компания из Голландии, история которой началась в 1891 году. Специализируется на здравоохранении, потребительских товарах и световых решениях.

Osram – немецкая высокотехнологическая фирма, основанная в 1906 году. Сфера ее деятельности – освещение.

MTF Light – российский товарный знак. Компания преимущественно занимается качественным автосветом.

Лучшие галогенные лампы Н4

Стандартные

MTF Light Long Life Standart + 30% – штатная модель с типом цоколя Н4, мощностью 60/55 Вт, напряжением 12 В и цветовой температурой 2900 К. Обладает дополнительными возможностями: на 30% увеличилась яркость; благодаря усовершенствованию нити накаливания вырос срок эксплуатации.

Стандартный привычный свет, излучающийся из прозрачных колб, обеспечивает отличную видимость и комфорт при вождении автотранспортом, независимо от природных условий. При изготовлении изделий используется специальное стекло, в значительной мере поглощающее ультрафиолет. Кроме того, для пластмассовых элементов фар температура нагрева лампочек абсолютно безопасна.

Достоинства:

соответствие требованиям стандарту ЕСЕ;
увеличенные эксплуатационный ресурс и количество излучаемого света;
надежность, хорошая видимость, обеспечение безопасности управления;
низкая стоимость и высокое качество позволяют при необходимости провести достойную экстренную замену, причем на долгий срок.

Недостаток:

редкие экземпляры могут перегореть за несколько месяцев.

Благодаря умелому комплексному подходу на разных стадиях создания изделия, производитель достиг отличного сочетания в оценочном критерии «качество / цена / эксплуатация». Поэтому лампочка пользуется спросом и считается одной из лучших в своем сегменте.

Сверхъяркие

Philips X-treme Vision +130% – автомобильная лампа напряжением 12 В и мощностью 60/55 Вт – c улучшенными техническими и эксплуатационными показателями. Рассчитана на срок эксплуатации 450 ч, видимость 130 м, цветовую температуру 3700 К и световой поток 1650/1000 лм. Оценить характеристики можно и в сравнении со стандартными значениями. Это на 20% белее, 45 м дальше и 130% светлее.

Модель сертифицирована по стандартам ЕСЕ, кроме того, в ней используется запатентованная технология, обеспечивающая усиление яркости. Благодаря таким показателям машина передвигается в более безопасном режиме – у водителя сравнительно имеется 2 дополнительные секунды, чтобы среагировать на внезапно возникшее препятствие. Выходящий пучок хорошо освещает соседние полосы и обочину, при этом не ослепляет встречных водителей.

Достоинства:

высококлассное кварцевое стекло, специальное покрытие, давление газа до 13 бар;
отличное качество, максимальная видимость, значительная производительность;
хороший обзор, четкая контрастность, высокая безопасность, комфортность вождения;
повышенная цветовая температура.

Недостаток:

у некоторых экземпляров долговечность меньше заявленной.

Подавляющее большинство пользователей в высшей степени положительно отзываются о модели. Светит она сильно и далеко, раньше срока перегорает редко.

Всепогодные

Osram Allseasen +30% – 3-контактная сертифицированная модель, характеризующаяся рабочими мощностями 60 и 55 Вт, а также напряжением 12 В и цветовой температурой 3000 К. Отличительные черты: интерференционное покрытие, повышенная на 30% светоотдача, увеличенная на 10 м зона видимости и приятные желтоватые лучи исходящего пучка. Благодаря конструкционным особенностям обеспечивается отличная видимость в непогоду – дискомфорт и неудобство вождения при тумане, дожде и снеге сводятся к минимуму. Наряду с хорошим освещением актуальных зон, другие участники движения не подвергаются ослеплению – при условии, что правильно выполнена регулировка. Кроме того, данная лампа по сравнению с аналогами излучает значительно меньше ультрафиолета.

Достоинства:

одинаково комфортное вождение как летом, так и зимой – отсутствуют блики и ослепление при плохой погоде;
во многих случаях отпадает необходимость в «противотуманках»;
широкий спектр, освещение ярче штатных экземпляров;
четкий контраст, хорошая видимость, безопасность управления машиной;
«приличный» ресурс, приятный лимонный цвет, бюджетная стоимость.

Недостаток:

иногда перегорание происходит значительно раньше срока.

Лампочки, по мнению пользователей, показывают себя «в деле» наилучшим образом и заслуживают, чтобы их со временем купить повторно. Некоторые водители (их немного) думают иначе – у них свет погас «до неприличия» быстро.

Долговечные

Philips LongLife EcoVision – экологичная и экономичная лампа для дальнего и ближнего фокусирования с цветовой температурой 3100 К, напряжением 12 В, световым потоком 1650 лм и мощностью 60/50 Вт. Самое примечательное, срок и пробег составляют 3000 ч и 100 тыс. км, что в 4 раза больше, чем обычно.

Кроме того, высококачественное стекло устойчивое к воздействию УФ лучей и высокого внутреннего давления, а также вибрации и перепадам температуры – выдерживает оно без разрушения +800 °С и попадание холодной воды на поверхность.

Цвет пучка – бело-желтый, позволяющий комфортно управлять машиной при неблагоприятных природных условиях. Товар изготавливается в соответствии со строгими нормативами ЕСЕ. Обладает разными высокими наградами.

Достоинства:

хорошая видимость соседних полос и обочины – исключается ослепления встречных участников движения;
необходимость замены освещения возникает крайне редко;
надежность, безопасность, колоссальный эксплуатационный ресурс;
долговечность, «хорошая» цена.

Недостаток:

проблема, как и у всех других аналогов – некоторые экземпляры иногда раньше срока выходят из строя.

Потребители в целом положительно высказываются об электрическом изделии. Особо их радует тот факт, что нет необходимости через каждые несколько месяцев производить замену.

Лучшие биксеноновые лампы Н4

Доступные

Sho-Me 4300 К – биксеноновая лампа мощностью 35 Вт, температурой свечения 4300 К, яркостью 2600 лм, напряжением 12 В. Срок службы составляет не менее 2000 ч. Цвет излучаемого пучка в данном случае – бело-желтый.

Установка осуществляется в машинах, световая система которых предусматривает совмещение в 1-ом изделии дальнего и ближнего фокуса – меняется он за счет изменения расстояния относительно отражателя.

Поскольку приведенные модели устроены по совсем другому принципу, чем лампочки накаливания, то для их функционирования необходимы блоки розжига. Эти электронные системы поставляются в комплекте в количестве 2-х штук – свою работу выполняют в течение 2 секунд.

Достоинства:

блок розжига для обхода бортового компьютера может поставляться с «обманкой»;
отличное качество, хороший свет, прекрасная видимость, достаточная мощность;
отсутствие перегорания, удобство при плохой погоде, при правильной настройке не ослепляются встречные;
простота в монтаже, низкая цена.

Недостаток:

иногда световые потоки могут цветом отличаться в фарах.

Всеобщая высокая оценка качества и эксплуатационных характеристик. Единственное, при неправильной настройке происходит ослепление водителей по встречной полосе.

Универсальные

MTF Light Slim Line 4300K – биксеноновая модель, характеризующаяся цветовой температурой 4300 К, мощностью 35 Вт, яркостью 3200 лм, сроком службы 2000 ч, напряжением 12 В, теплым белым цветом лучей. Две лампы комплектуются 2-мя тонкими блоками розжига, от электромагнитных помех защищают собственные экранирующие системы.

Усовершенствованная модификация изготавливается с шумоподавлением MSP. Кварцевое стекло колбы осуществляет блокировку УФ лучей. Рабочий диапазон температуры составляет от ‒40 до +95 °С.

Достоинства:

высокая устойчивость к воздействию механических нагрузок и вибрации;
силиконовое покрытие высоковольтных проводов;
быстрое зажигание при любой температуре;
надежность, широкий спектр, четкое освещение;
долговечность.

Недостаток:

Прекрасный биксеноновый комплект, после установки которого вождение становится значительно более удобным и комфортным, причем независимо от внешних факторов.

Лучшие светодиодные лампы Н4

Элитные

Philips LED X-treme Ultinon 6200 K – LED лампа, рассчитанная на 12 В, цветовую температуру 600 К, прибавку света на 150%, срок эксплуатации 12 лет. Для отвода тепла разработаны и применяются специальные системы охлаждения, благодаря чему значительно возрастает долговечность. С помощью технологии SafeBeam свет направляется только на объект назначения – исключается попадание лучей в глаза другим участникам движения. Кроме того, изделия легко устанавливаются – не обязательно обращаться для монтажа к работникам автосервиса.

Достоинства:

высочайшее качество, являющееся результатом инноваций, строгого производственного контроля и соблюдения стандартов ISO;
яркий и стильный белый цвет, отличная видимость, увеличение контролируемой зоны;
долголетие, независящее от режима эксплуатации.

Недостатки:

случаются поломки по разным причинам, в том числе из-за неправильной установки;
высокая цена.

Для многих пользователей такое освещения еще непривычное, но уже нравится – положительный эффект очевиден. Стоит надеяться, что LED лампочки со временем подешевеют.

Презентабельные

IPF Led Head 6500 K – LED модель с очень высокими световыми показателями. Характеризуется цветовой температурой 6500 К, яркостью 3600 лм, напряжением 12 В, мощностью 24 Вт, 50 тыс. ч ресурса. Среди особенности: несоосное расположение нитей накала, что приводит к отличному распределению света. Для понижения температуры предусмотрен радиатор охлаждения, изготовленный из специального сплава. При подключении к штатным разъемам фары нет необходимости в посредничестве драйверов и резисторов.

Достоинства:

широкий диапазон светораспределения, четкая линия контраста, равномерная дальняя освещенность;
при несложной установке и корректировке не возникает проблемы ослепления;
отличная видимость, позволяющая вовремя среагировать на аварийную дистанцию;
низкое потребление энергии, большой срок эксплуатации.

Недостаток:

Отличные осветительные приборы – пользователи оценили все достоинства, но также отметили высокую стоимость, которая отпугивает большинство потенциальных покупателей.

Какую лампу Н4 купить

После прочтения статьи ответить, какие лампы Н4 лучше купить, просто:

1. Для людей со слабым зрением – Philips X-treme Vision +130%.

2. Для таксистов, путешественников и жителей с «капризной» погодой – Osram Allseasen +30%.

3. Для водителей, часто пребывающих в черте города и предпочитающих размеренную езду – Philips LongLife EcoVision.

4. Любители биксенонового и светодиодного шарма могут приобрести Sho-Me 4300 К или IPF Led Head 6500 K.

Друзьям это тоже будет интересно

Хочешь получать актуальные рейтинги и советы по выбору? Подпишись на наш Telegram.

Галогеновые лампы, выбор по цоколям и назначению

Многие автомобили до сих пор используют в качестве освещения галогеновые лампы. Как правило, они имеют различную конструкцию колбы, цоколя и спирали. Это прямым образом зависит от их назначения и применения. Правила Европейской Экономической Комиссии ООН регламентируют о том, что требования с осветительным автомобильным приборам классифицируются по цоколям: Н4, Н3, Н2, Н1, НВ4, НВ3, НВ2, газоразрядные D1 и D2. Рассмотрим данные лампы более подробно.

Галогеновые лампы Н1 могут использоваться в противотуманных фарах. Противотуманные фары находится ниже головной оптики и предназначены для применения при плохих метеорологических условиях. Они освещают ту прослойку дороги, где тумана нет, обеспечивая водителя отличной видимостью. Использование галогеновых ламп в ПТФ идеально, так как их свет имеет желтый оттенок и не отражает капли осадков. Свет не рассеивается, а «проходит» через капли тумана, дождя, снега, максимально освещая дорогу. Но, все же, основным назначением ламп с типом цоколя Н1 является монтирование в фары дальнего света в 4-х фарной системе головного освещения машины. Такой тип освещения используется в автомобилях ВАЗ 2106 или авто марки BMW.

Лампы Н2 чаще всего применяются в автомобилях в противотуманных фарах. А некоторые машины французского производства монтируют их в дополнительной оптике Hella. При выборе галогенового освещения обязательно стоит обратить внимание на то, какой именно цоколь в вашем автомобиле. Если устанавливать такую же галогеновую лампу в авто с другим цоколем, то она не подойдет, вам придется менять либо конструкцию фары, либо идти за покупкой другой лампы. Будьте внимательны.

Лампы Н3 (с хвостиком) примерно 85 % применяются только в противотуманках. Это вполне логично, ведь, как было выше описано: галогеновый желтый свет прекрасно справляется с освещением при непогоде. Галогеновые лампы Н7 однонитевые и Н4 – двухнитевые международными нормами предусмотрены в традиционной 2-х фарной системе освещения автомобилей европейского производства типа CR. Лампы с типом цоколя Н7 появились совсем недавно и в основном применяются в машинах, которые сошли с автомобильного производственного конвейера после 1995 года. Такие транспортные средства оборудованы фарами, которые имеют свободную форму.

Теперь рассмотрим лампы с цоколями НВ4, НВ3, НВ2 и НВ1. Такие лампы соответствуют американским стандартам и соответственно используются в автомобилях американского производства (НВ1 и НВ2 – двухнитевые). Иногда они используются также и машинах японского качества (НВ3 и НВ4 – однонитевые). Особенностью таких ламп является то, что они имеют нестандартную конструкцию самого цоколя.

Главной же причиной такого отличия считается то, что с 1957 года во многих странах Европы принято ассиметричное распределение светового потока с четкой светотеневой границей. Производители ламп добились более освещенной части обочины, это больше предназначалось для пассажиров. Однако использование освещения с четкой границей света и тени разрешено только с 1997 года. Обязательным это не считалось. Освещение американских машин, за счет того, что симметричное, сильно ослепляло встречных водителей. Кроме всего прочего, американцы осуществляют регулировку фар только вертикально. Не стоит забывать и тот факт, что в регионах США и в Канаде нет одного порядка сертификации осветительных приборов для автомобиля до сих пор. Сегодня многие производители выпускают вместе с галогенными лампами и всесезонные, которые имеют более качественные характеристики.

Лампы с повышенным сроком эксплуатации

Подобные лампы предназначены для тех, кто использует свое транспортное средство «по полной», то есть практически круглосуточно. Они гарантируют использование такой продукции в два раза дольше. Увеличенный срок эксплуатации достигается путем использования при производстве специальной технологии и закачиванием специальной газовой смеси. Кстати, все вместе взятое обеспечивает лампе большую вибрационную стойкость, что тоже влияет на срок службы осветительного прибора. Такие известные бренды как Philips, Osram и Narva в лампах с повышенным сроком эксплуатации делают пометку – LongLife.

Марка	Название	Тип
Narva	LongLife (HD LL)	h2, Н11, Н7, НВ5, Н4, НВ4, НВ1
Philips	Heavy Duty Long Life (HD LL)	Н7, Н1, Н4, Н2, Н3, НВ4, НВ2 и НВ3
Osram	LongLife (L), Heavy Duty, Ultra Life	НВ2, Н1, Н7, Н4 и Н3

Галогеновые лампы с увеличенной светоотдачей на 50 % и 30%

Лампы такого типа появились несколько лет назад. Они как и все остальные лампы такого типа потребляют 55/60 Вт, но при этом имеют увеличенную светоотдачу на 30 %. Кстати, их стоимость такая же, как и обычных ламп накаливания. Причиной увеличенной светоотдачи является то, что лампы имеют большую температуру нити накала и особого состава газ. Все в совокупности исключает ускоренное выгорание. Лампы, которые имеют светоотдачу на 50 % больше характеризуются также и увеличенным пучком света на 5-10 метров, такое улучшение в освещении заметно даже невооруженным глазом. В данной группе такие лампы считаются новинкой. Благодаря такому типу освещению водитель замечает препятствия намного раньше, что значительно улучшает его безопасность на дороге. Такие лампы рекомендуется использовать водителям, которые имеют старые машины. Как правило, оптика таких автомобилей утратила первоначальную прозрачность текла и блеск отражателя.

Марка	Название	Тип
MTF	Argentum (+80 %)/(+50 %)	НВ4, Н1, НВ3, Н4, Н11
Narva	Range Power 50 (RP 50) (+50 %)	Н7, Н1 и Н4
Narva	Range Power (RP) (+30%)	НВ4, Н1, НВ3, Н7, Н3 и Н4
Koito	Whitebeam III
Philips	X-Treame Vision (+100 %)
	Premium (+30 %)	НВ3 и НВ4, Н7, Н4, Н1 и Н3
	Vision Plus (+50 %)	Н7, Н1 и Н4
Osram	Night Breaker plus +90 %
	Silverstar (+50 %)	Н7 и Н4
	Super (+30 %)	Н1, Н7, Н4 и н3

Лампы, излучающие свет с голубым оттенком (белый спектр)

Практически каждый водителей, хочет, чтобы его путешествие было максимально комфортным в темное время суток. Для этого следует применять очень яркие галогеновые лампы. Мировые фирмы-производители, стараясь облегчить видимость водителей в темное время суток, начали производить лампы со спектром свечения выраженного белого цвета. Несмотря на то, что они имееют народное название «голубой» цвет лампы, все же светят насыщенным белоснежным свечением. Такие лампы часто называют галогеновые лампы под ксенон, их свет настолько мощный и яркий, что похож на свечение ксеноновых источников света. Так как ксеноновые лампы считают лампами, приближенными к дневному свету, то они пользуются огромной популярностью. Их преимуществом можно считать то, что они монтируются в галогеновые цоколя машин, не требуя реконструкции оптики. Такие лампы отличаются от ламп накаливания только спектром свечения.

Марка	Название	Тип
МTF	Vanadium
Narva	Range power Blue (RPB)	НВ3 и НВ4, Н1, Н3, Н7 и Н4
Koito	Whitebeam
Philips	BlueVision, BlueVisionUltra, CristalVision, DiamondVision	Н1, НВ4/НВ3, Н3, Н7, Н4
Osram	CoolBlue, Cool Blue Intense	Н11, Н1, Н3, Н4, Н8, и Н7, Н9

Благодаря чему лампы имеют голубое свечение? Это происходит из-за того, что колба лампы покрашена в голубоватый оттенок. Стоит учесть, что глаза от такого света практически не устают, поэтому это идеальное освещение для длительных ночных поездок. Также благодаря такому свету, сохраняется световое пятно от освещения фонарем ночных улиц.

Лампы для тюнинга

Лампы, которые монтируются в автомобили для тюнинга – линейка «Silverstar» (они часто называются «невидимыми») серебристого цвета, являются последней разработкой современных технологов. Когда лампа монтируется в фару она сливается с отражателем, благодаря этому становится практически незаметной. Кроме этого, выпускаются лампы для обозначения поворотов, они называются «Diadem». По определению они имеют желтый цвет свечения, но также становятся невидимыми в фаре. Светят они только желтым цветом. Лампы c большей светоотдачей на 30 % и 50 % от компании Philips для тюнинга под названием «Рower2Night» отличаются от аналогичных световых приборов синим колпачком, который расположен на колбе, лампа упакована в красивую упаковку. Традиционно колпачок на других лампах имеет черный цвет. Особого внимания заслуживает мультиспекторовая лампа «Night Guide – 3 d 1». Она считается одним из уникальных разработок компании Philips, объединив в себе три популярных бестселлера: «VisionPlus +50 %», «Weathervision» и лампу линейки «BlueVision». Такая лампа отличается тем, что во время работы имеет три зоны освещения:

Спереди – свет с увеличенной светоотдачей на 50 % белого цвета, такой свет освещает видимый участок дороги на 10 -20 метров больше, чем ее аналоги;
Справа – свет имеет голубой оттенок, он отлично освещает все дорожные знаки и придорожную зону;
Слева – желтый свет, он отличается тем, что не слепит встречных водителей.

Выводы

Несмотря на то, что галогеновое освещение все реже используется в автомобилях и многие считают его неэффективным, вы все же можете подобрать лампу, которая улучшит показатели освещенности вашего автомобиля. Кроме этого, с помощью (уже немодных) галогенок можно произвести тюнинг оптики, установив лампу определенной линейки. В любом случае выбирать только вам, если у вас возникнут вопросы по подбору галогеновой лампы в ваш автомобиль, вы в любое время сможете позвонить нашим экспертам в этой области и получить бесплатную консультацию о товаре.

какие лучше светят, в чем их отличия, фото процесса установки и отзыв в сравнении с Osram

В этом обзоре я расскажу про ещё один тип светодиодных ламп. Первый вывод, который можно сделать при виде этой лампы, это отсутствие у неё светотеневой границы. Кроме этого у данной лампы ещё очень интересно реализован дальний свет. Далее более подробно.

Сразу оговорюсь, дабы избежать ругани в комментариях. С подобными лампами я не езжу, все обзоры ламп делаю интереса и удовольствия ради. В фаре стоит стандартная галогенка Osram, её можно будет увидеть в обзоре.

Лампа имеет стандартное металлическое основание, характерное для ламп с цоколем h5. Источником света служат 8 светодиодов, расположенные на алюминиевом столбике, по 4 светодиода с каждой стороны. Столбик со светодиодами защищен герметичной стеклянной колбой. Раз уж я сказал «герметичной» то давайте сразу поместим лампу в воду. Степень защиты здесь заявлена IP68.

В воде

Сделал скриншот погружения из видео версии обзора.

Приведу основные параметры лампы:

Степень защиты: IP68
Сертификат: ce/rohs
Световой поток: 1500 Лм
Цветовая температура: 6000 К
Напряжение питания: 9-30 В DC
Срок службы: более 100,000 часов

Далее, я измерил потребляемую мощность, в заявленном диапазоне рабочих напряжений 9-30 В. Из следующей таблицы видим, что средняя потребляемая мощность составила около 7Вт.

При нагреве, в небольшой картонной коробке, корпус лампы нагрелся 83.6 °С, как это можно видеть из следующей теплограммы. Нагрев проводился при напряжении 14.2 В, температура окружающего воздуха составляла +26 °С.

Многие лампы, имеют в своем корпусе вентилятор, из-за чего лампа может не уместиться в блок фары или в моем случае, может не надеться пыльник фары.

Однако данная лампа имеет габариты, идентичные стандартной галогенной лампе. Обычно светодиодные лампы для головного света имеют потребляемую мощность в диапазоне 20-35 Вт, здесь мощность значительно ниже. Однако слепить встречку этой лампе ничего не помешает.

Стандартный цоколь h5 имеет 3 контакта, один — общий, второй – положительный контакт для ближнего света, третий – положительный контакт для дальнего света. Здесь же, для дальнего и ближнего света, используются одни и те же светодиоды, которые светят с одинаковой яркостью для дальнего света и для ближнего. Т.е. при переключении с ближнего на дальний, или наоборот совершенно ничего не меняется.

Теперь посмотрим, как светит данная лампа. Для примера сравним её со штатной галогенной лампой. Видим, что данная лампа по центру имеет плохо освещенный участок, а по краям света немного больше. Слева – ближний и дальний свет галогенной лампы. Справа – ближний свет светодиодной лампы, он же дальний свет.

И ещё пара фотографий при свете, направленном вдаль. Все фотографии сделаны при одинаковой выдержке, одинаковой диафрагме и одинаковом значении ISO. Ниже, на крайней правой фотографии, видим темный участок, который находится непосредственно перед водителем. Получается так, что видим всё по бокам, но саму дорогу еле видно.

Лампа выпускается в различных видах цоколей, а именно: h2 h4 h5 H7 h21 h26 9005 9006.

Возможно, для противотуманок или каких-то подобных применений лампа годится, но устанавливать её в фару, головного света, рассчитанную на галогенную лампу h5, ни в коем случае нельзя. Эта лампа, именно в цоколе h5, занимает первое место по никчемности из всех ранее тестируемых мною ламп.

Ну и как обычно видео версия обзора:

На этом у меня всё.
Надеюсь обзор получился интересным.

Товар предоставлен для написания обзора магазином. Обзор опубликован в соответствии с п.18 Правил сайта.

Автомобильная светодиодная лампа Н4 H/L DLED Sparkle +

Автомобильные технологии в настоящее время развиваются крайне стремительно. Автолампы серии Dled Sparkle разработаны в соответствии с самыми передовыми инновационными технологиями. Теперь Вам больше не потребуется подворачивать свисающий балласт (драйвер) или выискивать место для громоздкого тепловентиляционного устройства (вентилятора для светодиодной автомобильной лампы). Специальный дизайн этих светодиодных автоламп разработан так, чтобы совершенно не нуждаться в наружном вентиляторе и не требует балласта (балласт встроен в саму лампу), чтобы сделать конструкцию более компактной и лампа могла войти в любую фару.

Питание этих светодиодных ламп обеспечивается двумя 18W высокомощными светодиодами, также имеется регулируемое основание, которое позволяет сфокусировать световой пучок в фаре, чтобы не слепить встречный транспорт и хорошо освещать дорогу.

Доступны светодиодные автомобильные лампы с цоколем HB3 9005 для головного ближнего или дальнего света либо противотуманных фар, чтобы придать Вашему автомобилю самый свежий и привлекательный вид, т. .к. лампы светят чисто белым светом в 5500К и по светооотдаче сопоставимы с ксеноном 2800lm. С нашими лампами дорога будет освещена намного лучше, и, в отличие от ксенона, Вы не будете слепить встречный транспорт либо иметь проблемы с ДПС.

Технические характеристики:

Кол-во светодиодов: 2
Тип светодиода: HP
Яркость: 3600 lumen
Цоколь: h5
Мощность: 36W
Цветовая палитра: белый 5500к

Отзывы об этом товаре:

Пока нет ни одного отзыва

Оставить свой отзыв:

Valerie Objects Подвесной светильник n4, латунь

Вы доставляете в мою страну?

Мы отправляем по всему миру в более чем 180 стран. Вы можете выбрать пункт назначения в левом верхнем углу нашего веб-сайта.

Сколько стоит доставка?

• Страны Европейского Союза (ЕС), Норвегия и Швейцария
В настоящее время мы предлагаем бесплатную * стандартную доставку для всех заказов на сумму более 150 €. Если общая стоимость заказа меньше 150 евро, стоимость доставки составит 7,90–14,90 евро в зависимости от веса и объема товара.* Применяются исключения: Великобритания и страны вне континента, такие как Мальта и Кипр.

• Международная доставка
Для стран, не входящих в Европейский Союз, стоимость доставки, начиная с 7,90 €, зависит от места назначения, веса и объема посылки. Стоимость доставки каждого товара указана на странице товара. Для громоздких и негабаритных предметов, таких как диваны, шезлонги, обеденные столы и т. Д., Вы можете запросить стоимость доставки, заполнив форму на странице продукта.Мы предоставим вам ценовое предложение в течение двух рабочих дней.

Какие способы доставки доступны?

Мы предлагаем следующие способы доставки:

• DHL Global Mail, от 7,90 €
Ваш заказ будет отправлен на адрес доставки или в местное почтовое отделение через DHL Global Mail. Стоимость доставки зависит от места назначения, веса и объема посылки и рассчитывается автоматически.

Европа: доставка вашего заказа может занять 4–8 рабочих дней.
Северная Америка: доставка вашего заказа займет 5–9 рабочих дней.
Австралия: доставка вашего заказа может занять 10–15 рабочих дней.
Остальной мир: доставка вашего заказа может занять 5–15 рабочих дней.

Вы сможете отследить свой заказ в течение 24–48 часов после его обработки в местном отделении DHL. Обратите внимание, что доступность информации для отслеживания зависит от страны назначения. DHL не предлагает отслеживание заказов, которые доставляются местной почтовой службой.DHL Global Mail доступна только для небольших посылок.

• DHL Parcel, от 8,80 € (Европа) / 15,99 € (за пределами Европы)
Ваш заказ будет доставлен по адресу доставки через DHL Parcel. Стоимость доставки зависит от места назначения и веса посылки и рассчитывается автоматически. Точная цена и предполагаемая дата доставки для вашей страны отображаются при оформлении заказа. DHL Parcel часто является наиболее экономичным способом доставки больших и легких предметов.

Вы можете отследить ваш заказ в течении 72 часов, он уже отправлен с нашего склада.После первой попытки доставки посылка будет доставлена в местный пункт самовывоза. Обратите внимание, что DHL Parcel доступен не для всех заказов.

• UPS Standard, от 6,00 €
Ваш заказ будет отправлен на адрес доставки через UPS Standard. Доставка вашего заказа может занять 2–7 рабочих дней. Срок доставки зависит от пункта назначения, и вы увидите предполагаемую дату доставки при оформлении заказа. Доставка осуществляется с понедельника по пятницу в обычные рабочие часы.Вы можете проверить точную стоимость доставки для вашей страны на страницах продукта и при оформлении заказа.

• UPS Expedited (для международных заказов)
Ваш заказ будет отправлен на адрес доставки через UPS Expedited. Доставка вашего заказа может занять 1-2 недели. Стоимость доставки зависит от места назначения, веса и объема посылки и рассчитывается автоматически. Срок доставки зависит от пункта назначения, и вы увидите предполагаемую дату доставки при оформлении заказа. Доставка осуществляется с понедельника по пятницу в обычные рабочие часы.

• UPS Express Saver
UPS Express Saver — самый быстрый доступный вариант доставки. Доставка вашего заказа может занять 1-2 рабочих дня. Стоимость доставки зависит от места назначения, веса и объема посылки и рассчитывается автоматически. Вы увидите предполагаемую дату доставки при оформлении заказа. Доставка осуществляется с понедельника по пятницу в обычные рабочие часы. Обратите внимание, что UPS Express Saver доступен не для всех заказов.

• TNT (для международных заказов)
Ваш заказ будет доставлен по адресу доставки с помощью службы TNT Economy Express или TNT Express.TNT часто является наиболее экономичным способом доставки громоздких и негабаритных предметов, таких как диваны, шезлонги и обеденные столы.

Стоимость доставки зависит от места назначения и веса посылки и рассчитывается автоматически. Точная цена и предполагаемая дата доставки для вашей страны отображаются при оформлении заказа.

TNT Economy Express: доставка вашего заказа может занять 4–8 рабочих дней.
TNT Express: доставка вашего заказа может занять 3–6 рабочих дней.

• DSV Freight
Все громоздкие и негабаритные предметы, такие как диваны, шезлонги, обеденные столы и т. Д., Будут отправлены с услугой DSV Freight.

• DSV Air Freight
Мебель и другие крупные предметы будут отправлены по адресу доставки через DVS Air Freight. Срок доставки 6–8 рабочих дней. После отправки заказа с нашего склада вы получите код отслеживания по электронной почте. DSV доставляет заказы только на улицу и заранее позвонит вам, чтобы назначить встречу с доставкой.Все заказы за пределами Европейского Союза будут отправлены как DAP (Delivered at Place), без оплаты пошлин.

Европа: доставка вашего заказа может занять 2–9 рабочих дней. Мы предлагаем бесплатную стандартную доставку для всех заказов на сумму более 150 €.
Остальной мир: Стоимость доставки и предполагаемая дата доставки будут указаны в расценке, предоставленной нашей службой поддержки клиентов.

Когда придет мой заказ?

Ориентировочное время доставки всего заказа можно посмотреть на кассе.

Настенный светильник, N ° 4, синий, L103см, h280см — Valerie_Objects

Valerie_Objects издает коллекцию настенных светильников, разработанную Studio Muller Van Severen.

Эти настенные светильники — первые светильники с потолочными светильниками, разработанные Фиеном Мюллером и Ханнесом Ван Севереном. Бельгийский дуэт представляет свои творения в 2011 году на персональной выставке в Валери Траан, галерее художественного руководителя valerie_objets.

Дизайн этого светильника почти наивно прост, но составляющие его линии игриво и красочно заполняют пространство.Настенный светильник № 4 состоит из изогнутой стальной трубы синего цвета и белого абажура, который, по словам Ханнеса Ван Северен, «имеет фантастическую форму: идеально нейтральный».

В гостиной, столовой, коридоре или офисе настенные светильники Muller Van Severen создают пространство в комнате, а не заполняют ее.

Доступны различные модели в синем, черном или латунном цвете по запросу. Настенный светильник имеет размеры 180 см в высоту и 103 см в длину. Деталь, прикрепленная к стене, составляет 170см. Диаметр абажура 25см.Лампа E27 в комплект не входит. Длина кабеля 5м.

Бельгийский дизайн.

Доставка:

— Для материковой Франции доступны три варианта доставки:

стандартная доставка, до 48 часов (для товара на складе): 6.90 €
доставка в пикап, до 48 часов (для товара на складе): 5.90 €
экспресс-доставка на следующий день до 13:00 (товар в наличии): 12,90 €

— Для Парижа и ближайших пригородов:

Livraison par Coursier dans la journée sous 3H (pour toute commande passée avant 15h): 14.90 €

— Для Европейского Союза, Швейцарии и Лихтенштейна доступна стандартная доставка: от 2 до 8 дней и от 9,90 € до 25 € в зависимости от страны.

(Не стесняйтесь проверить наш FAQ для получения дополнительной информации).

Возврат:

Все товары, купленные на Nedgis, можно вернуть.
Товар можно вернуть в течение 14 календарных дней, начиная со дня, следующего за днем, когда товар был получила. Чтобы вернуть товар, необходимо выполнить процедуру, описанную в разделе часто задаваемых вопросов или в Условиях использования.Затраты, связанные с возвратом продукта, оплачиваются покупателем.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — обзор и классификация методов последовательноспецифичного обнаружения

В течение последних 20 лет изотермические тесты амплификации нуклеиновых кислот превратились в важный диагностический инструмент не только для клинического применения, но и для контроля качества пищевых продуктов и мониторинга окружающей среды. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) хорошо известна своей надежной, высокочувствительной и специфической амплификацией целевой ДНК, которая достигается за счет использования до шести праймеров. Кроме того, LAMP выделяется своими изотермическими и энергоэффективными требованиями к усилению, что делает его главным кандидатом для недорогой диагностики и анализа в случае необходимости. В последнее время методы обнаружения, специфичные для последовательности, приобрели большее значение, поскольку, в отличие от методов обнаружения, не зависящих от последовательности, они обладают высокой специфичностью по отношению к целевой ДНК. За последние 13 лет появилось множество методов, зависящих от последовательности, основанных на очень разнообразном диапазоне методов зондирования, включая оптическое, магнитное, пьезоэлектрическое, электрохимическое и магниторезистивное зондирование.Чтобы дать структуру разнообразному множеству методов, специфичных для последовательности, мы создали систематическую классификацию и предоставили критическую сравнительную оценку в соответствии с каталогом критериев (аналитические характеристики, мультиплексирование, количественная оценка и инструментальные требования). Обнаружение на основе флуоресценции, составляющее половину методов, может обрабатываться на открытых платформах и удовлетворяет всем критериям, перечисленным ранее. Требования к инструментам обсуждаются с точки зрения сложности, портативности и жидкостных картриджей.Кроме того, оценивается уровень технологической готовности и тип платформы (открытая по сравнению с , адаптированная к методам), причем последняя играет важную роль в миниатюризации и автоматизации этапов рабочего процесса. Мы также наблюдаем рост использования датчиков, встроенных в смартфон, для улучшения тестирования точки необходимости на основе LAMP. Таким образом, последние разработки в методах последовательного обнаружения LAMP демонстрируют высокий потенциал для многих будущих приложений.

Разработка и проверка изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP) для быстрого обнаружения ZIKV в образцах комаров из Бразилии

org/ScholarlyArticle»> 1.

Дик, Г. У., Китчен, С. Ф. и Хаддоу, А. Дж. Вирус Зика. I. Выделения и серологическая специфичность. Trans R Soc Trop Med Hyg 46 , 509–520 (1952).

CAS Статья Google ученый

Муссо, Д. Передача вируса Зика из Французской Полинезии в Бразилию. Новые инфекционные заболевания 21 , 1887 г., https://doi.org/10.3201/eid2110.151125 (2015).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

Gatherer, D. & Kohl, A. Вирус Зика: ранее медленная пандемия быстро распространяется по Америке. Журнал общей вирусологии 97 , 269–273, https://doi.org/10.1099/jgv.0.000381 (2016).

CAS Статья PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 4.

Муссо Д., Ниллес Э. Дж. И Као-Лормо В. М. Быстрое распространение появляющегося вируса Зика в Тихоокеанском регионе. Клиническая микробиология и инфекции: официальное издание Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний 20 , O595–596, https: // doi.org / 10.1111 / 1469-0691.12707 (2014).

CAS Статья Google ученый

Менесес, Дж. Д. А. и др. . Уроки, извлеченные в эпицентре врожденной эпидемии вируса Зика в Бразилии: данные 87 подтвержденных случаев. Клинические инфекционные болезни: официальная публикация Американского общества инфекционных болезней 64 , 1302–1308, https://doi.org/10.1093/cid/cix166 (2017).

Артикул Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 6.

Марли Т. и др. . Диагностика на основе IgM к вирусу Зика тесно связана с обнаружением нейтрализующих антител у новорожденных с врожденным заболеванием. J Infect Dis ., Впервые опубликовано в Интернете 5 октября 2016 г., https://doi.org/10.1093/infdis/jiw477 (2016).

Феррейра, М. Л. Б. и др. . Синдром Гийена-Барре, острый диссеминированный энцефаломиелит и энцефалит, связанные с вирусной инфекцией Зика в Бразилии: позднее обнаружение РНК и выделение вируса. Американский журнал тропической медицины и гигиены 97 , 1405–1409, https://doi.org/10.4269/ajtmh.17-0106 (2017).

Артикул Google ученый

Петерсен, Л. Р., Джеймисон, Д. Дж., Пауэрс, А. М. и Хонейн, М. А. Вирус Зика. Медицинский журнал Новой Англии 374 , 1552–1563, https://doi.org/10.1056/NEJMra1602113 (2016).

CAS Статья PubMed Google ученый

Паттерсон, Дж., Сэммон, М. и Гарг, М. Денге, Зика и Чикунгунья: новые арбовирусы в Новом мире. Западный журнал экстренной медицины 17 , 671–679, https://doi.org/10.5811/westjem.2016.9.30904 (2016).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

10.

Элизондо-Кирога, Д. и др. . Авторская поправка: вирус Зика в слюнных железах пяти различных видов диких комаров из Мексики. Sci Rep 8 , 7887, https://doi.org/10.1038/s41598-018-25807-9 (2018).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 11.

Guedes, D. R. et al. . Репликация вируса Зика у москита Culex quinquefasciatus в Бразилии. Emerg Microbes Infect 6 , e69, https://doi.org/10.1038/emi.2017.59 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

12.

Смарт, К. Т., Шин, Д., Кан, С. и Табачник, В. Дж. Diptera: Culicidae) из Флориды, передаваемый вирус Зика. Front Microbiol 9 , 768, https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00768 (2018).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

13.

Гуо, Х. Х. и др. . Culex pipiens quinquefasciatus: потенциальный переносчик вируса Зика. Новые микробы и инфекции 5 , e102, https: // doi. org / 10.1038 / emi.2016.102 (2016).

Артикул Google ученый

14.

Диалло, Д. и др. . Появление вируса Зика у комаров на юго-востоке Сенегала, 2011 г. PloS one 9 , e109442, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109442 (2014).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

15.

Grischott, F., Пухан, М., Хац, К. и Шлагенхаф, П. Передача вируса Зика без переносчиков инфекции: систематический обзор. Медицина путешествий и инфекционные болезни 14 , 313–330, https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2016.07.002 (2016).

Артикул PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 16.

Маноре, К. А., Остфельд, Р. С., Агусто, Ф. Б., Гафф, Х. и ЛаДо, С. Л. Определение риска передачи вирусов Зика и Чикунгунья в центрах популяций людей на востоке США. Тропические болезни, игнорируемые PLoS 11 , e0005255, https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005255 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

17.

Ayllón, T. et al. . Ранние доказательства циркуляции вируса Зика среди комаров Aedes aegypti, Рио-де-Жанейро, Бразилия. Emerg Infect Dis 23 , 1411–1412, https://doi.org/10.3201/eid2308.162007 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

18.

Коста-да-Силва, А. Л. и др. . Лабораторные штаммы Aedes aegypti компетентны в отношении бразильского вируса Зика. PLoS One 12 , e0171951, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171951 (2017).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

19.

де Оливейра, В. К. и др. . Микроцефалия, связанная с инфекцией, после вспышек вируса Зика в 2015 и 2016 годах в Бразилии: анализ на основе эпиднадзора. Lancet 390 , 861–870, https://doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31368-5 (2017).

Артикул PubMed Google ученый

20.

Cevallos, V. et al. . Обнаружение вирусов Зика и Чикунгунья у естественно инфицированных Aedes aegypti в Эквадоре. Acta Trop 177 , 74–80, https://doi. org/10.1016/j.actatropica.2017.09.029 (2018).

Артикул PubMed Google ученый

21.

Фэй, О., Диалло, Д., Диалло, М., Вайдманн, М., Салл, А. А. Количественное определение вируса Зика с помощью ПЦР в реальном времени и оценка с помощью пойманных в полевых условиях комаров. Журнал вирусологии 10 , 311, https://doi.org/10.1186/1743-422X-10-311 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

22.

Вагонер, Дж. Дж. И Пинский, Б. А. Вирус Зика: диагностика возникающей пандемической угрозы. Журнал клинической микробиологии 54 , 860–867, https://doi.org/10.1128/JCM.00279-16 (2016).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 23.

Шукла С., Хонг С. Ю., Чанг, С. Х. и Ким, М. Стратегии быстрого обнаружения глобальной угрозы вируса Зика: текущее состояние, новые гипотезы и ограничения. Front Microbiol 7 , 1685, https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01685 (2016).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

24.

Шваб, С. Р., Стоун, К. М., Фонсека, Д. М. и Фефферман, Н. Х. Важность безотлагательности: влияние цели и масштаба эпиднадзора на борьбу с болезнями, передаваемыми комарами. Эпидемии 23 , 55–63, https://doi.org/10.1016/j.epidem.2017.12.004 (2018).

Артикул PubMed Google ученый

25.

Noden, BH, Martin, J., Carrillo, Y., Talley, JL & Ochoa-Corona, FM Разработка метода петлевой изотермической амплификации (LAMP) для быстрого скрининга клещей и блох на пятнистость лихорадка группы риккетсии. PLoS One 13 , e0192331, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192331 (2018).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

26.

Oloniniyi, O.K., Kurosaki, Y., Miyamoto, H., Takada, A. & Yasuda, J. Быстрое обнаружение всех известных видов эболавирусов с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). J Virol Methods 246 , 8–14, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.03.011 (2017).

CAS Статья PubMed Google ученый

27.

Адамс, Э. Р. и др. . Разработка и оценка нового анализа LAMP для диагностики кожного и висцерального лейшманиоза. J Clin Microbiol , https://doi.org/10.1128/JCM. 00386-18 (2018).

28.

Мори, Ю. и Нотоми, Т. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP): быстрый, точный и экономичный метод диагностики инфекционных заболеваний. Журнал инфекции и химиотерапии: официальный журнал Японского общества химиотерапии 15 , 62–69, https://doi.org/10.1007/s10156-009-0669-9 (2009).

CAS Статья Google ученый

29.

Немото, М. и др. . Обнаружение ротавируса лошадей с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). J Vet Med Sci 72 , 823–826 (2010).

CAS Статья Google ученый

30.

Song, J. et al. . Молекулярное обнаружение вируса Зика без использования инструментов. Anal Chem 88 , 7289–7294, https://doi.org/10.1021/acs.analchem. 6b01632 (2016).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

31.

Тиан Б. и др. . Обнаружение аттомолярных олигонуклеотидов вируса Зика на основе петлевой изотермической амплификации и AC-сенсептометрии. Biosens Bioelectron 86 , 420–425, https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.06.085 (2016).

CAS Статья PubMed Google ученый

32.

Ван, Х. и др. . Быстрое и чувствительное обнаружение вируса Зика с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией. J Virol Methods 238 , 86–93, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2016.10.010 (2016).

CAS Статья PubMed Google ученый

33.

Ли Д. и др. . Простая и высокочувствительная молекулярная диагностика вируса Зика с помощью анализа бокового потока. Anal Chem 88 , 12272–12278, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b03460 (2016).

CAS Статья PubMed Google ученый

34.

Chotiwan, N. et al. . Быстрое и специфическое обнаружение вирусов Зика азиатского и африканского происхождения. Sci Transl Med 9 , https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aag0538 (2017).

org/ScholarlyArticle»> 35.

Yaren, O. et al. .Точка отбора проб вируса Зика в мультиплексном наборе, способном обнаруживать лихорадку денге и чикунгунью. BMC Infect Dis 17 , 293, https://doi.org/10.1186/s12879-017-2382-0 (2017).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

36.

Lamb, L.E. et al. . Быстрое обнаружение вируса Зика в образцах мочи и инфицированных комаров с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией. Sci Rep 8 , 3803, https://doi.org/10.1038/s41598-018-22102-5 (2018).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

37.

Kaarj, K., Akarapipad, P. & Yoon, J. Y. Упрощенный, быстрый и чувствительный анализ вируса Зика с использованием смартфона для обнаружения петлевой изотермической амплификации на бумажных микрожидкостных чипах. Sci Rep 8 , 12438, https: // doi.org / 10.1038 / s41598-018-30797-9 (2018).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

38.

Куросаки Ю. и др. . Разработка и оценка быстрого молекулярного диагностического теста на вирусную инфекцию Зика с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией. Sci Rep 7 , 13503, https://doi.org/10.1038/s41598-017-13836-9 (2017).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

39.

Гуэдес, Д. Р. и др. . Репликация вируса Зика у москита Culex quinquefasciatus в Бразилии. Новые микробы и инфекции 6 , e69, https://doi.org/10.1038/emi.2017.59 (2017).

Артикул Google ученый

40.

Lanciotti, R. S. et al. . Генетические и серологические свойства вируса Зика, связанного с эпидемией, штат Яп, Микронезия, 2007. Новые инфекционные болезни 14 , 1232–1239, https: // doi.org / 10.3201 / eid1408.080287 (2008).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

41.

Пайва, М. Х. С., Гуэдес, Д. Р. Д., Лил, В. С. и Эйрес, К. Ф. Дж. Чувствительность метода ОТ-ПЦР в образцах, положительных на вирус Зика с помощью ОТ-кПЦР в исследованиях компетентности векторов. Генетика и молекулярная биология 40 , 597–599, https://doi.org/10.1590/1678-4685-GMB-2016-0312 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

42.

Даффи, М. Р. и др. . Вспышка вируса Зика на острове Яп, Федеративные Штаты Микронезии. Медицинский журнал Новой Англии 360 , 2536–2543, https://doi.org/10.1056/NEJMoa0805715 (2009).

CAS Статья PubMed Google ученый

43.

Li, X. F. et al. . Характеристика клинического изолята вируса Зика 2016 г. у нечеловеческих приматов. EBioMedicine 12 , 170–177, https: // doi.org / 10.1016 / j.ebiom.2016.09.022 (2016).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 44.

Pessôa, R. et al. . Расследование вспышки болезни, похожей на денге, в Пернамбуку, Бразилия, выявило коциркуляцию вируса Зика, Чикунгунья и вируса денге типа 1. Лекарство (Балтимор) 95 , e3201, https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000003201 (2016).

Артикул Google ученый

45.

Magalhaes, T. et al . Распространение вируса Зика в результате вспышки чикунгуньи в Ресифи, Бразилия. PLoS Negl Trop Dis 11 , e0006055, https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006055 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

46.

Кампос Р. Э. М. и др. . Длительное обнаружение РНК вируса Зика в образцах мочи во время продолжающейся эпидемии вируса Зика в Бразилии. J Clin Virol 77 , 69–70, https://doi.org/10.1016/j.jcv.2016.02.009 (2016).

Артикул Google ученый

47.

Zammarchi, L. et al. . Вирусные инфекции Зика, завезенные в Италию: клинические, иммунологические и вирусологические данные, а также последствия для общественного здравоохранения. Журнал клинической вирусологии: официальное издание Панамериканского общества клинической вирусологии 63 , 32–35, https: // doi.org / 10.1016 / j.jcv.2014.12.005 (2015).

Артикул Google ученый

48.

Zhao, J. & Feng, R. Чувствительное и быстрое обнаружение вируса Зика с помощью петлевой изотермической амплификации. Вирусные гены , https://doi.org/10.1007/s11262-018-1612-x (2018).

49.

Таннер, Н. А. и Эванс, Т. С. Петлевая изотермическая амплификация для обнаружения нуклеиновых кислот. Curr Protoc Mol Biol 105 , Раздел 15.14, https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1514s105 (2014).

50.

Calvert, AE, Biggerstaff, BJ, Tanner, NA, Lauterbach, M. & Lanciotti, RS Быстрое колориметрическое определение вируса Зика в образцах сыворотки и мочи с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP) . PLoS One 12 , e0185340, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185340 (2017).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

51.

Priye, A. et al. . Диагностическая платформа на базе смартфона для быстрого обнаружения вирусов Зика, чикунгунья и денге. Sci Rep 7 , 44778, https://doi.org/10.1038/srep44778 (2017).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

52.

Бекманн, Дж. Ф. и Фаллон, А. М. Обезглавливание улучшает обнаружение Wolbachia pipientis (Rickettsiales: Anaplasmataceae) у комаров Culex pipiens (Diptera: Culicidae) с помощью полимеразной цепной реакции. Журнал медицинской энтомологии 49 , 1103–1108 (2012).

CAS Статья Google ученый

53.

Парди К. и др. . Быстрое и недорогое обнаружение вируса Зика с использованием программируемых биомолекулярных компонентов. Cell 165 , 1255–1266, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.059 (2016).

CAS Статья PubMed Google ученый

54.

Sabalza, M. et al . Обнаружение вируса Зика с использованием LAMP обратной транскрипции в сочетании с анализом обратного дот-блоттинга в слюне. PLoS One 13 , e0192398, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192398 (2018).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

55.

Гангули А. и др. . Диагностика на базе смартфона без помощи рук для одновременного обнаружения вирусов Зика, Чикунгунья и Денге в месте оказания медицинской помощи. Biomed Microdevices 19 , 73, https://doi.org/10.1007/s10544-017-0209-9 (2017).

CAS Статья PubMed Google ученый

56.

Чан, К. и др. . Быстрое, доступное и портативное молекулярное устройство средней производительности для вируса Зика. Sci Rep 6 , 38223, https://doi.org/10.1038/srep38223 (2016).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

57.

Каросино, М. и др. . Оценка развертываемой в полевых условиях изотермической ПЦР с обратной транскрипцией для быстрого и чувствительного обнаружения вируса Зика на месте. BMC Infect Dis 17 , 778, https://doi.org/10.1186/s12879-017-2852-4 (2017).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 58.

Fernandes, J. N. et al. . Быстрое неинвазивное обнаружение вируса Зика в. Sci Adv 4 , eaat0496, https://doi.org/10.1126/sciadv.aat0496 (2018).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

Быстрое и простое колориметрическое обнаружение множественных вирусов гриппа, инфицирующих людей, с использованием диагностической платформы изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP) | BMC Infectious Diseases

Грипп (сезонный) Информационный бюллетень.http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal).

Грипп (птичий и другой зоонозный) Информационные бюллетени. http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(avian-and-other-zoonotic).

Глобальная информационная система по болезням животных EMPRES. http://empres-i.fao.org/eipws3g/.

Обновление ситуации H7N9. http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/h7n9/situation_update.html. По состоянию на 30 апреля 2019 г.

Dobrovolny HM, Gieschke R, Davies BE, Jumbe NL, Beauchemin CA. Ингибиторы нейраминидазы для лечения штаммов гриппа человека и птиц: сравнительное модельное исследование. J Theor Biol. 2011. 269 (1): 234–44.

CAS Статья Google ученый

Хсюн Г. Диагностическая вирусология: от животных к автоматизации. Yale J Biol Med. 1984; 57 (5): 727.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Чен М.И., Барр И.Г., Ко Г.К., Ли В.Дж., Ли С.П., Шоу Р., Лин Ц., Яп Дж., Кук А.Р., Тан Б.Х. Серологический ответ в ОТ-ПЦР подтвердил вирус гриппа a h2N1-2009 с помощью анализов ингибирования гемагглютинации и нейтрализации вируса: обсервационное исследование. PLoS One. 2010; 5 (8): e12474.

Артикул Google ученый

Zhang W, Evans DH. Обнаружение и идентификация вирусов гриппа человека с помощью полимеразной цепной реакции. J Virol Methods.1991. 33 (1-2): 165–89.

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 9.

Vasoo S, Stevens J, Singh K. Экспресс-тесты на антигены для диагностики пандемического (свиного) гриппа a / h2N1. Clin Infect Dis. 2009. 49 (7): 1090–3.

Артикул Google ученый

10.

Лукас П.М., Морган О.В., Гиббонс Т.Ф., Герреро А.С., Мопин Г.М., Батлер Дж.Л., Канас Л.С., Фонсека В.П., Олсен С.Дж., Макинтош В.Х. Диагностика пандемического гриппа A (ph2N1) 2009 г. и сезонного гриппа с помощью экспресс-тестов на антиген гриппа, Сан-Антонио, Техас, апрель – июнь 2009 г.Clin Infect Dis. 2011; 52 (Suppl_1): S116–22.

Артикул Google ученый

11.

Faix DJ, Sherman SS, Waterman SH. Чувствительность экспресс-теста к новому вирусу гриппа свиного происхождения a (h2N1) у людей. N Engl J Med. 2009. 361 (7): 728–9.

Артикул Google ученый

12.

Ким Д. К., Пудель Б. Инструменты для обнаружения вируса гриппа. Йонсей Мед Дж. 2013; 54 (3): 560–6.

CAS Статья Google ученый

13.

Махони JB. Обнаружение респираторных вирусов молекулярными методами. Clin Microbiol Rev.2008; 21 (4): 716–47.

CAS Статья Google ученый

14.

Бай Г.Р., Сакода Ю., Мвине А.С., Фуджи Н., Минакава Х., Кида Х. Усовершенствование набора для быстрой диагностики для выявления вирусных инфекций гриппа A или B. J Vet Med Sci. 2006. 68 (1): 35–40.

Артикул Google ученый

15.

Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. ПЦР в реальном времени в вирусологии. Nucleic Acids Res. 2002. 30 (6): 1292–305.

CAS Статья Google ученый

16.

Kozel TR, Burnham-Marusich AR. Тестирование на инфекционные заболевания в пунктах оказания помощи: прошлое, настоящее и будущее. J Clin Microbiol. 2017; 55 (8): 2313–20.

CAS Статья Google ученый

17.

Канеко Х., Иида Т., Аоки К., Оно С., Сузутани Т.Чувствительное и быстрое обнаружение ДНК вируса простого герпеса и вируса ветряной оспы с помощью петлевой изотермической амплификации. J Clin Microbiol. 2005. 43 (7): 3290–6.

CAS Статья Google ученый

18.

Ито М., Ватанабе М., Накагава Н., Ихара Т., Окуно Ю. Быстрое обнаружение и типирование гриппа А и В с помощью петлевой изотермической амплификации: сравнение с иммунохроматографией и выделением вируса. J Virol Methods. 2006. 135 (2): 272–5.

CAS Статья Google ученый

19.

Цай Т., Лу Дж., Ян Дж., Сюй Д., Мэн З. Разработка и оценка петлевой изотермической амплификации в реальном времени для количественной оценки ДНК вируса гепатита В: новый инструмент для лечения ВГВ. J Clin Virol. 2008. 41 (4): 270–6.

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 20.

Хуанг Дж., Сунь Й., Лю И, Сяо Х., Чжуан С. Разработка метода изотермической амплификации, опосредованного петлей, для быстрого обнаружения провирусной ДНК вируса артрита-энцефалита коз.Arch Virol. 2012. 157 (8): 1463–9.

CAS Статья Google ученый

21.

Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T., Watanabe K, Amino N, Hase T. Петлевая изотермическая амплификация ДНК. Nucleic Acids Res. 2000; 28 (12): E63.

CAS Статья Google ученый

22.

Таннер Н.А., Чжан Ю., Эванс Т.С. младший. Визуальное обнаружение изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием pH-чувствительных красителей.Биотехники. 2015. 58 (2): 59–68.

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 23.

Имаи М., Ниномия А., Минекава Х., Нотоми Т., Ишизаки Т., Таширо М., Одагири Т. Разработка системы H5-RT-LAMP (петлевой изотермической амплификации) для быстрой диагностики вируса птичьего гриппа H5 инфекционное заболевание. Вакцина. 2006. 24 (44–46): 6679–82.

CAS Статья Google ученый

24.

Луо С, Се З, Се Л, Лю Дж, Дэн Х, Хуанг Л, Хуанг Дж, Цзэн Т., Хан М.И. Петлевой изотермический анализ обратной транскрипции для чувствительного и быстрого обнаружения вирусов птичьего гриппа подтипа h20. Вирол Дж. 2015; 12: 145.

Артикул Google ученый

25.

Ма XJ, Shu YL, Nie K, Qin M, Wang DY, Gao RB, Wang M, Wen LY, Han F, Zhou SM и др. Визуальное обнаружение вируса пандемического гриппа a h2N1 2009 путем изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией, с использованием красителя гидроксинафтоловый синий. J Virol Methods. 2010. 167 (2): 214–7.

CAS Статья Google ученый

26.

Накаучи М., Такаяма И., Такахаши Х., Таширо М., Кагеяма Т. Разработка метода изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией, для быстрой диагностики инфекции вируса птичьего гриппа a (H7N9). J Virol Methods. 2014; 204: 101–4.

CAS Статья Google ученый

27.

Nakauchi M, Yoshikawa T., Nakai H, Sugata K, Yoshikawa A, Asano Y, Ihira M, Tashiro M, Kageyama T. Оценка изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией, для быстрой диагностики вируса пандемического гриппа a / h2N1 2009. J Med Virol. 2011; 83 (1): 10–5.

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 28.

Nemoto M, Yamanaka T., Bannai H, Tsujimura K, Kondo T., Matsumura T. Разработка и оценка изотермического анализа изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией, для вируса гриппа лошадей h4N8.J Virol Methods. 2011. 178 (1–2): 239–42.

CAS Статья Google ученый

29.

Nemoto M, Yamanaka T., Bannai H, Tsujimura K, Kondo T, Matsumura T. Разработка метода изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией, для вируса гриппа лошадей H7N7. J Vet Med Sci. 2012. 74 (7): 929–31.

CAS Статья Google ученый

30.

Shigemoto N, Fukuda S, Takao S, Shimazu Y, Tanizawa Y, Kuwayama M, Ohara S.Быстрое обнаружение нового вируса гриппа A и вирусов сезонного гриппа a (h2N1, h4N2) с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). Kansenshogaku Zasshi. 2010. 84 (4): 431–6.

Артикул Google ученый

31.

Lee YJ, Choi YK, Kim YJ, Song MS, Jeong OM, Lee EK, Jeon WJ, Jeong W, Joh SJ, Choi KS и др. Высокопатогенный вирус птичьего гриппа (H5N1) среди домашних птиц и взаимоотношения с перелетными птицами, Южная Корея.Emerg Infect Dis. 2008. 14 (3): 487–90.

CAS Статья Google ученый

32.

Чой В.С., Пэк Ю.Х., Квон Дж.Дж., Чон Дж.Х., Пак С.Дж., Ким И.И., Юн С.В., Хван Дж., Ким М.Х., Ким СиДжей и др. Быстрое приобретение полиморфных маркеров вирулентности при адаптации высокопатогенного вируса птичьего гриппа H5N8 к мыши. Научный отчет 2017; 7: 40667.

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 33.

Бранкстон Г., Гиттерман Л., Хирджи З., Лемье С., Гардам М. Передача гриппа а у людей. Lancet Infect Dis. 2007. 7 (4): 257–65.

Артикул Google ученый

34.

Jayawardena S, Cheung CY, Barr I, Chan KH, Chen H, Guan Y, Peiris JM, Poon LL. Петлевая изотермическая амплификация вируса гриппа A (H5N1). Emerg Infect Dis. 2007; 13 (6): 899.

CAS Статья Google ученый

35.

Nie K, Zhao X, Ding X, Li XD, Zou SM, Guo JF, Wang DY, Gao RB, Li XY, Huang WJ и др. Визуальное обнаружение инфекции человека вирусом гриппа A (H7N9) с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции, с помощью красителя гидроксинафтоловый синий. Clin Microbiol Infect. 2013; 19 (8): E372–5.

CAS Статья Google ученый

36.

Mahony J, Chong S, Bulir D, Ruyter A, Mwawasi K, Waltho D. Анализ мультиплексной петлевой изотермической амплификации (M-LAMP) для обнаружения гриппа a / h2, a / h4 и гриппа B может поставить диагноз «образец-результат» за 40 минут с учетом чувствительности к единичной копии генома.J Clin Virol. 2013. 58 (1): 127–31.

CAS Статья Google ученый

37.

Chi Y, Ge Y, Zhao K, Zou B, Liu B, Qi X, Bian Q, Shi Z, Zhu F, Zhou M и др. Мультиплексная изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции, в сочетании с каскадной инвазивной реакцией и гибридизацией наночастиц для подтипа вируса гриппа А. Научный доклад 2017; 7: 44924.

CAS Статья Google ученый

38.

Tang Y, Diao Y, Yu C, Gao X, Chen L, Zhang D. Быстрое обнаружение вируса Тембусу путем обратной транскрипции, петлевой изотермической амплификации (RT-LAMP). Transbound Emerg Dis. 2012. 59 (3): 208–13.

CAS Статья Google ученый

39.

Имаи М., Ниномия А., Минекава Х., Нотоми Т., Ишизаки Т., Ван Ту П., Тьен НТК, Таширо М., Одагири Т. Быстрая диагностика инфекции вируса птичьего гриппа H5N1 с помощью недавно разработанного гена гемагглютинина гриппа H5. специфический петлевой метод изотермической амплификации.J Virol Methods. 2007. 141 (2): 173–80.

CAS Статья Google ученый

org/ScholarlyArticle»> 40.

Динева М.А., Махилум-Тапей Л., Ли Х. Подготовка образцов: проблема при разработке анализов на основе нуклеиновых кислот в условиях ограниченных ресурсов. Аналитик. 2007. 132 (12): 1193–9.

CAS Статья Google ученый

41.

Бавыкин С.Г., Аковский Ю.П., Захариев В.М., Барский В.Е., Перов А.Н., Мирзабеков А.Д.Портативная система для подготовки микробных проб и анализа олигонуклеотидных микрочипов. Appl Environ Microbiol. 2001. 67 (2): 922–8.

CAS Статья Google ученый

42.

Priye A, Bird SW, Light YK, Ball CS, Negrete OA, Meagher RJ. Диагностическая платформа на базе смартфона для быстрого обнаружения вирусов Зика, чикунгунья и денге. Научный отчет 2017; 7: 44778.

CAS Статья Google ученый

Оценка и усовершенствование методов изотермической амплификации для диагностики острой болезни растений

Abstract

Ряд технологий изотермической амплификации ДНК утверждают, что они идеальны для приложений в точке потребности (PON), поскольку они позволяют проводить реакции с использованием однотемпературного источника тепла (например,грамм. водяная баня). Таким образом, мы исследовали несколько методов изотермического усиления, сосредоточив внимание на простоте, стоимости, чувствительности и воспроизводимости, чтобы определить наиболее подходящий метод (-ы) для приложений PON с низким уровнем ресурсов. Ряд методов был признан непригодным, так как они либо включали инкубацию при нескольких температурах, либо были относительно дорогими, либо требовали относительно больших количеств целевой ДНК для амплификации. Среди исследованных методов изотермическая амплификация с помощью петли (LAMP) и амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) оказались наиболее подходящими для приложений PON, поскольку они оба являются одностадийными методами, которые обеспечивают высокочувствительные и воспроизводимые амплификации. Скорость LAMP-реакций была значительно увеличена, до 76%, с добавлением праймеров петли, в то время как присутствие праймеров роя и секвестрация свободных ионов магния с нуклеотидами также увеличивали скорость амплификации. Напротив, мы не смогли улучшить производительность RPA из оригинальной опубликованной литературы. Хотя и RPA, и LAMP имеют некоторые недостатки, любую изотермическую технологию можно надежно использовать для диагностики на месте с минимальным оборудованием.

Образец цитирования: Zou Y, Mason MG, Botella JR (2020) Оценка и усовершенствование методов изотермической амплификации для точной диагностики болезней растений.PLoS ONE 15 (6): e0235216. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216

Редактор: Руслан Календар, Университет Хельсинки, ФИНЛЯНДИЯ

Поступила: 15 февраля 2020 г .; Дата принятия: 10 июня 2020 г .; Опубликовано: 29 июня 2020 г.

Авторские права: © 2020 Zou et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файле вспомогательной информации.

Финансирование: Автор (ы) не получил специального финансирования для этой работы.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Диагностика заболеваний — это критически важный первый шаг в лечении заболеваний, который обычно выполняется в современных лабораторных помещениях квалифицированным персоналом из-за сложности применяемых методов.Помещения для тестирования часто расположены далеко от мест отбора проб, что приводит к увеличению затрат на транспортировку образцов, а также к задержкам в выявлении и лечении заболеваний. Таким образом, было бы очень полезно выполнять диагностику в точке необходимости (PON), например, в полевых условиях [1], поскольку это позволяет быстро внедрять стратегии управления заболеваниями [2–4].

Амплификация ДНК

представляет собой мощную платформенную технологию для диагностических приложений благодаря своей скорости, чувствительности, специфичности, рентабельности и адаптивности [5, 6].Наиболее широко используемым методом амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР) [7], однако потребность в термоциклере делает диагностику на основе ПЦР более подходящей для лабораторного тестирования, чем диагностика PON [8]. Потребность в молекулярной диагностике PON в последнее время вызвала значительный интерес к методам изотермической (однотемпературной) амплификации ДНК, поскольку для них требуется только простой и недорогой источник тепла [9]. В сочетании с тепловыми блоками, портативными инструментами или водяными банями изотермическое усиление использовалось для обнаружения возбудителей заболеваний у людей (например,грамм. Campylobacter [10], вирус чикунгуньи [11]) и растения (например, Fusarium oxysporum [12], flavescence dorée phytoplasma [13]).

Амплификация ДНК

при постоянной температуре, как правило, становится возможной благодаря способности ДНК-полимераз к вытеснению цепей, используемых в изотермических методах [6]. В большинстве изотермических методов ДНК-полимеразы ферментативно разделяют нити ДНК вместо того, чтобы полагаться на повышенные температуры, как в ПЦР [14-17]. Другие изотермические методы, такие как амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) [18], используют ферменты, такие как ДНК-рекомбиназа, для облегчения отжига праймеров, в то время как одноцепочечные ДНК-связывающие белки удерживают стойки ДНК, позволяя ДНК-полимеразе инициировать синтез ДНК [19, 20].Разделение цепей ДНК во время амплификации также может быть достигнуто с помощью геликазы, как при геликазозависимой амплификации (HDA) [21–24].

Изотермическая амплификация ДНК имеет два ключевых преимущества перед традиционной амплификацией на основе ПЦР для диагностических приложений. Во-первых, устройство, необходимое для инкубации реакции, может быть значительно меньше и дешевле, поскольку оно потребует меньше энергии, чем термоциклер, а в некоторых случаях оно может работать без электричества [25, 26] [27]. Во-вторых, изотермическая амплификация более чувствительна и быстрее, чем ПЦР [28], поскольку она не полагается на дискретные термические циклы, такие как ПЦР, а скорее включает непрерывную амплификацию, которая может привести к обнаружению ампликонов в течение 10 минут.Кроме того, есть несколько сообщений, которые предполагают, что изотермические технологии, такие как LAMP с 6-8 сайтами связывания праймеров, могут приводить к большей специфичности, чем методы, основанные на ПЦР [29, 30]. Комбинация изотермической амплификации с последними достижениями в диагностических технологиях, такими как технология очистки нуклеиновых кислот с помощью индикаторной полоски [31] и технология считывания невооруженным глазом [32], будет способствовать развитию платформ молекулярной диагностики с поддержкой PON. В этом исследовании мы подробно рассмотрели несколько перспективных изотермических технологий, чтобы определить наиболее подходящие для диагностики PON.Мы оценили скорость, стоимость, техническую простоту и предел обнаружения каждого метода.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Целью этого исследования было определение подходящего метода (ов) амплификации для диагностики PON. После первоначальной оценки, основанной на имеющейся в литературе информации, было выбрано несколько методов из-за их технической простоты, относительно низкой стоимости и скорости. Затем эти методы были проанализированы более подробно, включая предел обнаружения, воспроизводимость, скорость амплификации и надежность, для определения подходящего метода (ов) для целей PON.На последнем этапе этого исследования в два из этих методов было внесено несколько модификаций с целью улучшения либо скорости усиления, либо надежности.

Препарат ДНК-матрицы

Очищенная ДНК из Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans и Arabidopsis thaliana экотипа Колумбия использовались в качестве целевой ДНК и нецелевой ДНК, соответственно, на протяжении всего исследования.

Геномная ДНК из A . thaliana очищали с использованием модифицированного метода экстракции ДНК CTAB [33]. А . thaliana листьев измельчали до тонкого помола с использованием жидкого азота. Приблизительно 100 мг листовой влаги добавляли в 500 мкл буфера для экстракции при 60 ° C (2% (мас. / Об.) CTAB, 1,42 М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 1% мас. / Об. Поливинилирилодона [PVP40 ]). Экстракт инкубировали при 60 ° C в течение 45 минут, а затем смешивали с 500 мкл охлажденного хлороформа: изоамилалхол (24: 1, об. / Об.). Смесь осторожно встряхивали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем центрифугировали при 15000 g в течение 10 минут.200 мкл супернатанта переносили в новую пробирку и смешивали с 400 мкл охлажденного этанола перед тем, как смесь центрифугировали при 15000 g в течение 10 минут для осаждения ДНК. Осадок ДНК промывали последовательно 80% этанолом, 100% этанолом. Чтобы денатурировать РНК в образце, осадок суспендировали в 100 мкл воды и 50 мкг РНКазы A, а затем инкубировали при 37 9 · 1068 o 9 · 1069 ° C в течение 20 минут. Образец смешивали с 10 мкл 3M ацетата натрия и 100 мкл изопропанола с последующей инкубацией при -20 9 · 1068 o 9 · 1069 ° C в течение 10 минут.После центрифугирования при 15000 g в течение 2 минут получали осадок ДНК, который затем промывали 80% этанолом. После высыхания ДНК суспендировали в 50 мкл воды и количественно определяли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000.

ДНК из F . conglutinans был очищен из чистых жидких культур. Вкратце, три агаровых блока размером 5 мм × 5 мм вырезали из чашки со свежей культурой и переносили в 200 мл картофельного бульона с декстрозой, а затем инкубировали в шейкере при 28 9 1068 o 9 1069 ° C со скоростью 110 об / мин.Примерно через 4 дня жидкую культуру фильтровали через 4 слоя Miracloth с получением F . conglutinans мицелий. Затем мицелий тонко измельчали с использованием жидкого азота. Приблизительно 100 мг тонкого мицелия добавляли к 400 мкл буфера для экстракции (150 мМ трис-основания, 2% SDS, 50 мМ EDTA, 1% v / v b-меркаптоэтанол, pH 7,5) и перемешивали в течение 5 минут. 100 мкл этанола, 44 мкл 5 М ацетата калия добавляли в экстракт соответственно перед 1-минутным перемешиванием после добавления каждого реагента.К смеси добавляли 500 мкл хлороформ: изоамилалхол (24: 1, об. / Об.) И встряхивали в течение 1 минуты с последующим центрифугированием на максимальной скорости в течение 3 минут. Приблизительно 500 мкл супернатанта переносили в новую пробирку и смешивали с 500 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1, об. / Об.). После центрифугирования на максимальной скорости в течение 3 минут 400 мкл супернатанта смешивали с 800 мкл охлажденного этанола и затем инкубировали при -20 9 1068 o 9 10 69 C в течение 30 минут. После центрифугирования при 15000 g в течение 10 минут ДНК осаждали и затем промывали 80% этанолом с последующей обработкой РНКазой, промывкой этанолом, количественным определением ДНК, как описано выше в разделе «Экстракция ДНК из A ». Талиана .

Усиление

Если не указано иное, LAMP-амплификации содержали 0,8 М бетаина, 8 мМ MgSO ₄, 1,2 мМ dNTP (каждый), 20 мМ Трис-HCl (pH 8,8), 10 мМ (NH ₄) ₂ SO ₄, 10 мМ KCl, 0,1% (об. / Об.) Triton® X-100, 1,6 мкМ праймера FIP, 1,6 мкМ праймера BIP, 0,2 мкМ праймера F3, 0,2 мкМ праймера B3 и 0,32 Ед / мкл полимеразы теплого старта Bst 2.0 (New Биолаборатория Англии). 10 мкл реакционной смеси инкубировали при 63 ° C в течение 60 минут, а затем при 85 ° C в течение 5 минут для денатурации ферментов.

Компоненты реакций CPA и PSR были идентичны реакциям LAMP, за исключением праймеров. 0,5 мкМ праймера 1s, 0,3 мкМ праймеров 2a, 3a, 4s и 5a использовали в реакциях CPA, и 0,5 мкМ праймера 1s, 0,3 мкМ праймеров 3a и 5a и 0,05 мкМ праймеров 4s и 6a использовали в модифицированных CPA-реакции (mCPA). Реакции PSR содержали 1,6 мкМ Ft и Bt, 0,8 мкМ IF и IB. 10 мкл реакционной смеси инкубировали при 63 ° C в течение 60 минут в CPA или 75 минут в PSR, а затем при 85 ° C в течение 5 минут.

SEA реакции содержали 2 мМ MgSO ₄, 0,5 мМ dNTP (каждый), 20 мМ Трис-HCl (pH 8,8), 10 мМ (NH ₄) ₂ SO ₄, 10 мМ KCl, 0,1% Triton®-X-100, 10% (мас. / Об.) PEG-300, 1 мкМ прямого и обратного праймеров и 0,8 Ед / мкл полимеразы Bst 2.0 с теплым стартом. 10 мкл реакционной смеси инкубировали при 63 ° C в течение 180 минут.

TwistAmp Basic RPA (Twist DX) использовался, как описано в инструкциях производителя. Вкратце, один осадок RPA регидратировали 29.Добавляют 5 мкл буфера для регидратации, 0,48 мкМ прямых и поощрительных праймеров и воду, чтобы получить 42,5 мкл раствора. Смесь равномерно распределяли по пяти пробиркам по 0,2 мл и добавляли 1 мкл матрицы ДНК. Если не указано иное, непосредственно перед инкубацией в реакции добавляли 0,5 мкл 280 мМ ацетата магния. Затем 10 мкл реакционной смеси RPA инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, а затем при 95 ° C в течение 5 минут для денатурирования белков и высвобождения ампликона. После инкубации 2 мкл продуктов RPA смешивали с 1 мкл красителя, содержащего 2% SDS, и проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле.

Выбор праймера

Множественные наборы праймеров были разработаны для каждого изотермического метода (S1 Excel) и протестированы с использованием очищенного F . conglutinans ДНК использовали в качестве целевой ДНК. Наборы праймеров исключались, если они вызывали неспецифическую амплификацию в водном контроле или не вызывали какой-либо амплификации с F . conglutinans ДНК. Один набор функциональных праймеров (таблица S1) был выбран для каждого метода и использован в остальных тестах.

Предел обнаружения

0, 0,01, 0,1, 1, 5, 25 или 50 нг очищенного F . oxysporum ДНК добавляли в каждый тип изотермической реакции с конечным объемом 10 мкл. Компоненты в реакциях и условия амплификации для каждого метода были такими, как описано в разделе «Амплификация» выше.

Анализ флуоресценции в реальном времени

Для мониторинга реакции в режиме реального времени к реакциям LAMP или RPA добавляли дополнительно 1,25 мкМ SYTO9 (Invitrogen).1 нг очищенного F . oxysporum ДНК и 1 нг A . thaliana ДНК были добавлены в качестве целевой ДНК и нецелевой ДНК, соответственно. За реакциями объемом 10 мкл следили с помощью аппарата для ПЦР в реальном времени Lightcycler 96 (Roche) при соответствующей температуре реакции с флуоресцентными измерениями, выполняемыми каждые 20 секунд.

На основе необработанных данных в реальном времени значения дельта (Δ) флуоресценции были рассчитаны путем вычитания начального значения флуоресценции каждого образца из каждого значения.Чтобы рассчитать время достижения каждым образцом установленного порогового значения флуоресценции (0,5 в LAMP и 0,05 в RPA), было собрано не менее 21 точки данных, охватывающих фазу логарифмического роста, и сопоставлено с линией регрессии со значением r ². не менее 0,95 в Microsoft Excel. Затем функция TREND использовалась для вычисления времени для каждой выборки, чтобы достичь порогового значения (T _threshold).

ПЦР-амплификация

10 мкл реакционной смеси для ПЦР содержали 1 мастер-микс FastStart Essential DNA green (Roche), 0.2 мкМ каждого праймера и 10 нг целевой ДНК, 10 нг нецелевой ДНК или вода. Реакции проводили на термоциклере реального времени Lightcycler 96 со следующими параметрами: 95 ° C в течение 10 минут, затем 45 циклов при 95 ° C в течение 10 секунд, 65 ° C в течение 10 секунд, 72 ° C в течение 20 секунд.

Улучшение усиления LAMP

Чтобы проверить, может ли RecA ускорять LAMP, 0,75 мкг RecA (New England Biolabs) и 1 мМ АТФ были добавлены в 10 мкл реакции (n = 10), содержащей либо 0 M, либо 0.4 М или 0,8 М бетаина. Чтобы исследовать влияние нуклеотидов в отсутствие RecA, в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0,4 М бетаина ( n = 3) соответственно. В дальнейших экспериментах 4,8, 8,8 или 12,8 мМ dNTP (всего) добавляли в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0,4 М бетаина (n = 3) и 8 или 10 мМ Mg ²⁺. Чтобы исследовать эффекты праймеров роя и петли для амплификации LAMP, праймеры были сконструированы (таблица S1), как описано в их соответствующих публикациях [35, 36].0,8 мкМ праймеры прямой и обратной петли и / или 1,6 мкМ праймеры прямого и обратного роя добавляли в 10 мкл реакционных смесей, содержащих 0,4 М бетаина (n = 4).

1 нг F . oxysporum ДНК использовали в качестве целевой ДНК-матрицы. Все реакции проводили на Lightcycler 96 при 63 ° C в течение 60 минут, а затем при 85 ° C в течение 5 минут.

Влияние бетаина на функцию RPA

Бетаин добавляли в 10 мкл стандартных реакций RPA (описанных выше, n = 4), содержащих 1 нг F . oxysporum ДНК в конечной концентрации 0, 0,4 или 0,8 М. Все реакции проводили на Lightcyler 96 при 37 ° C в течение 60 минут перед денатурированием при 85 ° C в течение 5 минут.

Статистика

Для сравнения двух наборов данных данные были проанализированы с использованием непарного t-критерия (непараметрического) в GraphPad Prism (версия 7. 0b) (p ≤ 0,05). Все остальные наборы данных были проанализированы путем выполнения одностороннего дисперсионного анализа с последующим апостериорным сравнением теста Тьюки на средние значения (р ≤ 0,05) в GraphPad Prism.

Результаты

Первоначальный выбор методов изотермического усиления с потенциальными приложениями PON

Чтобы определить изотермические технологии, подходящие для приложений PON, большое количество изотермических технологий было первоначально оценено с точки зрения технической простоты, стоимости и скорости на основе доступной литературы. Мы исключили методы, которые включали многократные температурные инкубации (например, амплификацию смещения цепи [37]), были относительно дорогими (например,грамм. зависимая от геликазы амплификация [21]) или требуются специальные шаблоны или несколько стадий ферментативной реакции (например, амплификация по методу катящегося круга [38]). На основании этой оценки мы выбрали пять методов для дальнейшей работы: амплификация с обменом цепей (SEA), полимеразная спиральная реакция (PSR), кросс-прайминг-амплификация (CPA), рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA) и петлевой изотермической амплификации (LAMP). SEA и RPA используют прямой и обратный праймеры, аналогичные тем, которые используются в ПЦР, для амплификации интересующей мишени (S1 Рис.) И используют замещающую цепь ДНК-полимеразу или комбинацию рекомбиназы и одноцепочечных ДНК-связывающих белков соответственно, чтобы обеспечить амплификацию в одном температура.Напротив, LAMP, PSR и CPA используют сложные конструкции праймеров (S1 фиг.) И ДНК-полимеразы с замещением цепей для генерации ампликонов.

Расчет и выбор грунтовки

Чтобы напрямую сравнить методы амплификации, мы разработали несколько наборов праймеров против одной и той же области генома грибкового патогена растений Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans (GenBank: AB256753.1, последовательность S1) для каждого метода (S1 Excel). Все три набора праймеров RPA продуцировали ампликоны ожидаемого размера для целевой ДНК (S2A фиг.).Четыре из шести наборов праймеров LAMP амплифицировали целевую ДНК, в то время как один набор показал неспецифическую амплификацию в контролях с водой, а другой не смог продуцировать продукт (S2B фиг. ). Однако нам было сложно найти надежные наборы праймеров для оставшихся трех методов (CPA, SEA и PSR).

Все восемь наборов праймеров PSR либо не генерировали ампликоны, либо демонстрировали неспецифическую амплификацию в водных контролях при разработке в соответствии с инструкциями из исходной публикации. Однако в последующих публикациях описаны улучшения PSR за счет добавления дополнительных внутренних праймеров (S1 Fig) [39, 40].Реализация этой модификации позволила успешно амплифицировать один набор праймеров PSR (S2C на фиг.). Точно так же все три набора праймеров CPA, разработанные, как описано в исходной публикации [15], либо не смогли генерировать ампликон из целевой ДНК, либо были склонны к образованию неспецифических ампликонов в водных контролях (S3A фиг.). Однако амплификация была достигнута за счет сохранения той же конструкции праймера, что и в исходном методе CPA, то есть двух прямых и трех обратных праймеров, но путем замены праймера «2a» другим праймером (мы назвали «6a») ниже по течению (S3B Рис. ) .Мы назвали этот метод модифицированным CPA (mCPA), чтобы отличить его от оригинального опубликованного метода. Наш метод mCPA показал надежные амплификации ДНК-мишени и не дал какой-либо амплификации в контрольных водах во время тестирования (S3C Рис). К сожалению, три набора праймеров, разработанные для амплификации SEA, либо не смогли амплифицироваться из целевой ДНК, либо показали неспецифическую амплификацию в водных контролях, и поэтому они были исключены из оставшейся части нашего исследования. Для каждой из оставшихся изотермических технологий был выбран единый функциональный набор праймеров, который использовался на протяжении всей остальной части этого исследования (таблица S1).

Сравнение пределов обнаружения

Затем мы сравнили чувствительность каждой технологии, проверив их способность производить ампликон с разными начальными количествами (от 0,01 до 50 нг) F . oxysporum геномной ДНК в четырех независимых экспериментах для оценки воспроизводимости каждого метода. LAMP продуцировал видимые ампликоны во всех четырех повторных реакциях, содержащих ≥ 0,1 нг ДНК (рис. 1A), но только в 50% реакций образовывался ампликон при введении 0,01 нг ДНК.RPA дал почти идентичные результаты с LAMP с амплификацией в 100% реакций с ≥ 0,1 нг ДНК и 25% реакций, содержащих 0,01 нг ДНК (рис. 1B). Напротив, и PSR, и mCPA требовали большего количества ДНК для надежной амплификации продукта. PSR показал 100% воспроизводимость при добавлении 50 нг ДНК, но не всегда демонстрировал амплификацию с меньшими количествами матрицы (рис. 1C). mCPA генерировал ампликоны в 100% реакций, содержащих ≥ 25 нг, но не демонстрировал воспроизводимой амплификации с более низкими количествами матрицы (рис. 1D).Относительно высокое количество ДНК, необходимое для воспроизводимой амплификации в mCPA и PSR (в 250 и 500 раз соответственно выше, чем LAMP и RPA), делает их непригодными для типичной диагностики PON [9] и поэтому исключены из дальнейшего анализа.

Рис. 1. Предел обнаружения различных методов изотермического усиления.

Очищенный F . oxysporum Геномная ДНК (0, 0,01, 0,1, 1, 5, 25, 50 нг) была использована в качестве целевой ДНК для ( A ) LAMP, ( B ) RPA, ( C ) PSR или ( D ) амплификация mCPA.Число под каждой полосой показывает, сколько раз каждый метод генерировал ампликон в четырех независимых экспериментах. Рис. 1A и 1D получены из одного и того же изображения геля, которое отличается от исходного изображения геля на рис. 1B или рис. 1C (необработанные изображения S1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.g001

Сравнение скорости усиления

Мы исследовали время, необходимое LAMP и RPA, чтобы надежно различать положительные и отрицательные реакции.Положительные реакции содержали очищенный F . oxysporum ДНК (целевая ДНК), в то время как негативы содержали либо A, . thaliana ДНК (ДНК, не являющаяся мишенью) или вода. При амплификации RPA реакции, содержащие ДНК-мишень (n = 3), показали увеличение флуоресценции по сравнению с фоновыми уровнями в течение 9 минут после начала реакции. Напротив, контрольные образцы воды и контрольные образцы ДНК, не являющиеся мишенями, показали базальные уровни флуоресценции через 14 минут (рис. 2А). В соответствии с результатами, полученными в режиме реального времени, анализ ампликонов RPA с помощью гель-электрофореза выявил наличие сильной, четко определенной полосы ДНК ожидаемого размера в положительных образцах.Важно отметить, что все реакции RPA, включая воду и контрольные ДНК, не являющиеся мишенями, производили неспецифические ампликоны (S4, фиг.). Подобные результаты наблюдались в трех независимых экспериментах, в которых использовались новые наборы реагентов RPA. Когда одни и те же праймеры и матрицы RPA использовались в реакциях ПЦР в реальном времени с использованием полимеразы Taq, в целевой ДНК были обнаружены сильные сигналы амплификации, в то время как амплификация не происходила ни в нецелевой ДНК, ни в контроле воды (S5 фиг. ), Что указывает на то, что продукты неспецифической амплификации, наблюдаемые в реакциях RPA, не вызваны дизайном праймера или проблемой контаминации, а являются неотъемлемой частью RPA.

Рис. 2. Обнаружение флуоресценции в реальном времени амплификаций RPA и LAMP.

1нг Ф . oxysporum ДНК добавляли в реакции ( A ) RPA или ( B ) LAMP (n = 3) в качестве целевой ДНК (синяя сплошная линия). 1 нг A . thaliana. Геномную ДНК и воду добавляли в реакции (n = 3) в качестве нецелевой ДНК (красная пунктирная линия) и воды для контроля (зеленая пунктирная линия) соответственно.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0235216.g002

В реакциях LAMP целевая ДНК проявляла амплификацию примерно через 30 минут после начала инкубации, в то время как нецелевые ДНК и контрольные воды показали значения базальной флуоресценции во время 120-минутной инкубации (Рис. 2B).

Влияние времени подготовки на амплификацию

На объекте обработка проб не выполняется одновременно, особенно в неоптимальную погоду или когда необходимо обработать большое количество проб, что приводит к задержкам. Таким образом, для диагностических методов критически важно допускать небольшие задержки во время подготовки образца, не влияя на надежность результатов. Мы намеренно ввели 10-минутную задержку между установкой образца и инкубацией, поскольку, по нашему опыту, это время, необходимое для обработки небольшого количества (10–15) реакций. Заранее подготовили два идентичных набора реакций как для LAMP, так и для RPA, содержащих все необходимые реагенты, за исключением целевой ДНК. Целевая ДНК была добавлена за 10 минут до начала инкубации к одному набору реакций (n = 4) для моделирования отложенных образцов, в то время как для второго набора (n = 4) целевая ДНК была добавлена непосредственно перед инкубацией, чтобы имитировать нестандартные образцы. -замедленные образцы.Неотложенные реакции RPA показали результаты, аналогичные нашим предыдущим наблюдениям (рис. 2A), в которых реакции, содержащие ДНК-мишень, показали амплификацию немного раньше, чем контрольные образцы с водой (рис. 3A). Примечательно, что отсроченные реакции RPA приводили к кривым амплификации, на которых ДНК-мишень и контрольные воды были неразличимы. Напротив, 10-минутная задержка не повлияла на результаты LAMP-реакций (рис. 3B).

Рис. 3. Влияние 10-минутной задержки во время подготовки образца на амплификации RPA и LAMP.

Два набора полных реакций ( A ) RPA или ( B ) LAMP (n = 4) были приготовлены заранее. 1 н. Целевой ДНК (синяя сплошная линия) и воду (голубая пунктирная линия) были добавлены в первую серию реакций за 10 минут до начала инкубации, чтобы имитировать 10-минутную задержку во время подготовки образца. Непосредственно перед началом инкубации целевая ДНК (красная сплошная линия) или вода (пурпурная пунктирная линия) были добавлены во второй набор реакций для имитации образцов без задержки.( C ) Два набора реакций RPA (n = 4) были приготовлены таким же образом, как на фиг. 3A, за исключением того, что ацетат магния добавляли к каждому образцу непосредственно перед началом инкубации.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.g003

Затем мы проверили, может ли добавление ацетата магния, критического компонента в реакции амплификации RPA, непосредственно перед началом инкубации улучшить артефакты, вызванные задержкой и восстановлением способности RPA различать ДНК-мишень и контроли воды. Для этого целевую ДНК добавляли в реакции (n = 4) без ацетата магния либо за 10 минут до, либо непосредственно перед инкубацией при 37 ° C. Добавление ацетата магния выполняли непосредственно перед инкубацией. Используя эту стратегию, все водные контроли, отсроченные и не отсроченные, сгруппированы вместе с характерным сдвигом в кинетике амплификации, что позволило отличить их от целевой ДНК (рис. 3C).

Улучшения усиления LAMP

Сообщалось о ряде улучшений эффективности LAMP, таких как добавление рекомбиназы RecA вместе с необходимым субстратом АТФ [41] и удаление бетаина [42].Чтобы оценить комбинированный эффект обоих методов лечения, мы сравнили время, необходимое для каждого образца, чтобы достичь порога флуоресценции 0,5 в LAMP в реальном времени, сокращенно T _threshold в этом исследовании. Комбинация RecA и 0 M бетаина в реакции приводила к статистически значимому снижению порогового значения T на три минуты по сравнению с контролями без RecA (n = 10, значение p <0,05). Дальнейший анализ реакций LAMP без бетаина показал, что они склонны давать ложноположительные результаты, причем обычно одна из каждых трех реакций дает ампликон в отсутствие целевой ДНК, с добавлением или без добавления RecA (S6A фиг.).Напротив, реакции, содержащие 0,8 М бетаина, не дали ложноположительных результатов (S6B, фиг.). Поскольку 0,4 M бетаина, независимо от добавления RecA, значительно снижало порог T _{по сравнению со стандартными реакциями LAMP, содержащими 0,8 M бетаина и не содержащими RecA (рис. 4A), во всех последующих экспериментах использовалось минимум 0,4 M бетаина.}

Рис. 4. Влияние добавления бетаина, рекомбиназы и нуклеотидов на амплификацию LAMP.

( A ) Различные комбинации RecA и бетаина использовались в реакциях LAMP, содержащих 1 нг целевой ДНК и 1 мМ АТФ, и время, необходимое для достижения каждым образцом порога флуоресценции, равного 0.5 (порог T ) в режиме реального времени LAMP (n = 10). ( B ) RecA и / или АТФ добавляли в реакции, содержащие 0,4 М бетаина. Реакции без RecA и АТФ использовали в качестве контроля (n = 3). «+» И «-» под каждой полосой указывают на наличие и отсутствие компонента соответственно. ( C ) Дополнительный 1 мМ АТФ, dATP, dTTP, dCTP или dGTP добавляли в реакции, содержащие 0,4 М бетаина. Реакции без дополнительных АТФ и дНТФ использовали в качестве контроля. ( D ) В реакции, содержащие 0.4 M бетаин (n = 3). Для исследования взаимодействия между dNTP и Mg ²⁺, 4,8 мМ (темно-синий), 8,8 мМ (красный) или 12,8 мМ (зеленый) общий dNTP был добавлен в реакции, содержащие 0,4 М бетаина и либо ( E ) 8 мМ Mg. ²⁺ или ( F ) 10 мМ Mg ²⁺ соответственно. ( G ) Были подготовлены два набора реакций, содержащих 0,4 М бетаина и либо 0 мМ (черный), либо 2 мМ (серый) АТФ. В каждую серию реакций добавляли дополнительные праймеры для роя и / или петли вместе со стандартными праймерами LAMP.В качестве контролей использовали только стандартные праймеры LAMP (n = 4). Все данные T _{, пороговые значения}, анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным множественным сравнением критериев Тьюки для средних значений (значение p <0,05). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.g004

Дальнейшие эксперименты показали, что комбинация RecA и АТФ значительно снижает порог T _{для реакций LAMP на семь минут по сравнению с реакциями без этих двух компонентов ( Рис 4B).Неожиданно мы обнаружили, что большая часть улучшения была обусловлена АТФ, поскольку добавление только АТФ, без RecA, снижало пороговое значение} реакции Т _{на шесть минут (рис. 4В).}

Затем мы проверили, могут ли реакции LAMP быть усилены нуклеотидами, отличными от АТФ. Пороговое значение Т реакций, содержащих дополнительный 1 мМ dATP, dTTP, dCTP или dGTP, были аналогичны реакциям, содержащим 1 мМ АТФ, и значительно быстрее, чем контрольные реакции без каких-либо дополнительных нуклеотидов (рис. 4C).Оптимальная концентрация АТФ составляла 2–3 мМ, тогда как концентрации АТФ выше 3 мМ АТФ вызывали возрастающие пагубные эффекты, а амплификации не наблюдалось при концентрациях АТФ от 6 мМ и выше (рис. 4D).

Чтобы изучить взаимодействие между концентрацией магния и нуклеотидов в реакциях LAMP, мы проверили влияние нескольких концентраций dNTP и Mg ²⁺ на скорость амплификации. Когда общая концентрация dNTP была увеличена со стандартных 4,8 мМ до 8,8 мМ, порог T _{значительно снизился на 6 минут (фиг. 4E).Однако дальнейшее увеличение общей концентрации dNTP до 12,8 мМ полностью ингибировало амплификацию. Когда концентрация Mg ²⁺ была увеличена до 10 мМ от стандартных 8 мМ, 4,8 мМ dNTP было недостаточно для включения амплификации, и для амплификации требовалась концентрация dNTP 8,8 мМ (рис. 4F). Опять же, дальнейшее увеличение концентрации dNTP до 12,8 мМ ингибировало реакцию.}

Добавление праймеров петли [35] и роя [36] может увеличить скорость амплификации LAMP, и, таким образом, мы исследовали, может ли комбинация АТФ и этих дополнительных праймеров дополнительно усиливать амплификацию. В отсутствие АТФ праймеры «роя» или «петля» резко снижали порог T _{на десять и двадцать четыре минуты соответственно (фиг. 4G). В реакциях, содержащих праймеры петель, добавление праймеров роя не приводило к дальнейшему снижению порога T . Добавление АТФ увеличивало скорость амплификации в стандартных LAMP-реакциях и реакциях, содержащих роевые праймеры, на семь и три минуты соответственно, но не снижало пороговое значение} T _{в реакциях, содержащих праймеры для петель.}

Основываясь на наших наблюдениях, что включение бетаина помогло избежать неспецифической амплификации в реакциях LAMP (S6, фиг.), Мы проверили, может ли бетаин также снижать или устранять неспецифическую амплификацию в водных контролях RPA. Добавление 0,4 или 0,8 М бетаина не оказало значительного влияния на порог T _{в присутствии целевой ДНК по сравнению с реакциями без бетаина (фиг. 5). Неспецифическая амплификация в контроле с водой не подавлялась добавлением 0.4 M бетаина, тогда как включение 0,8 M бетаина приводило к задержке продукции неспецифических ампликонов на одну минуту.}

Рис. 5. Влияние бетаина на амплификацию RPA.

1 нг целевой ДНК (черный) добавляли в реакции RPA, содержащие различное количество бетаина. Воду (серая) использовали в качестве контроля. Время, необходимое для каждого образца для достижения порога флуоресценции 0,05 (порог T ) в RPA в реальном времени, анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (n = 4, значение p <0,05).Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.g005

Обсуждение

В этом исследовании мы изучили ряд методов изотермической амплификации, которые потенциально могут быть использованы в PON благодаря заявленной простоте, чувствительности и специфичности. Наши результаты показали, что, за исключением RPA, разработка праймера более сложна, чем это представляется в оригинальных публикациях. Дизайн праймеров RPA аналогичен ПЦР, и все наборы праймеров RPA, разработанные в этом исследовании, успешно амплифицировали свои мишени (фигура S2A). Напротив, 67% испытанных наборов праймеров LAMP показали специфическую амплификацию своей целевой ДНК (S2B фиг.). Это не было неожиданностью, поскольку для LAMP требуется минимум четыре праймера для нацеливания на шесть сайтов связывания со строгими требованиями в отношении расстояний между каждым из сайтов связывания, в то время как каждый праймер также должен соответствовать определенным условиям, таким как соответствие узкому диапазону температур плавления [43] . Сложный дизайн праймеров LAMP делает разработку праймеров трудоемкой, и может потребоваться адаптация неоптимальных наборов праймеров, когда доступная геномная последовательность ограничена.Однако, по нашему опыту, после разработки надежного набора праймеров амплификация LAMP представляет собой простой в выполнении метод со многими преимуществами в качестве инструмента диагностики PON. Недавно разработанные SEA, CPA и PSR представляют собой простые одностадийные изотермические методы, в которых используется та же ДНК-полимераза с замещением цепей, что и LAMP, но их конструкции праймеров намного проще. Однако ни один из наборов праймеров, разработанных для трех методов в соответствии с руководящими принципами, изложенными в исходных публикациях, не смог амплифицировать их целевую ДНК без неспецифической амплификации в водных контролях.Причины плохой работы праймера для этих изотермических методов неизвестны, но наши результаты предполагают, что существуют особые требования для PSR, CPA и SEA, которые не были задокументированы. Последующие модификации наборов праймеров PSR и CPA позволили специфическую амплификацию целевой ДНК, однако чувствительность методов была на несколько порядков ниже по сравнению с LAMP и RPA, что делало их непрактичными для приложений молекулярной диагностики (рис. 1).

Наше прямое сравнение методов изотермической амплификации показало, что только LAMP и RPA обеспечивают подходящую надежность и чувствительность для диагностических целей (рис. 1A и 1B) [9].По сравнению с LAMP, RPA кажется привлекательной технологией для диагностики, поскольку она быстрее (рис. 2) и имеет более простую конструкцию праймеров. Однако, в отличие от LAMP, RPA часто вызывает неспецифическую амплификацию в контроле воды, о чем сообщали другие группы, включая изобретателей технологии [18, 44, 45]. Неспецифическая амплификация, наблюдаемая в RPA, не является следствием используемых праймеров, поскольку одни и те же праймеры не приводили к неспецифическим ампликонам при использовании в реакциях ПЦР (S5 Фиг.).Возможно, что когда температура реакции намного ниже, чем значения Tm праймеров, рекомбиназа, используемая в RPA, может опосредовать неправильное связывание праймера с нецелевыми мишенями, включая следовые количества ДНК Escherichia coli , которая обычно совместно очищается с рекомбинантными ферментами, такими как как полимеразы и рекомбиназы, обнаруженные в реакции RPA [46, 47]. Добавление 0,8 М бетаина к реакциям RPA снизило скорость неспецифической амплификации на 8% (фиг. 5), но не устранило ее, как мы наблюдали в реакциях LAMP (S6 фиг.).

Гель-электрофорез можно использовать для дифференциации целевых и неспецифических ампликонов RPA (S4 Рис. ), Однако электрофорез нецелесообразен для приложений PON, поскольку он требует значительного количества лабораторного оборудования, включая УФ-световой бокс, резервуар для гель-электрофореза и соответствующую мощность поставлять. Возможное решение — использовать специальные зонды для определения правильных ампликонов. Комбинация меченых флуоресцентных зондов [11, 48] и коммерческих портативных машин для ПЦР в реальном времени является одним из жизнеспособных вариантов для включения специфической амплификации RPA в PON.В качестве альтернативы, RPA-реакции могут быть запущены на устройстве с боковым потоком (LFD), в котором только правильный ампликон будет иммобилизован на тестовой полосе устройства и помечен специальным зондом [49, 50]. Однако система обнаружения LFD значительно увеличивает стоимость метода и увеличивает риск перекрестного загрязнения образцов предыдущими ампликонами RPA.

В отличие от RPA, набор праймеров LAMP, выбранный для нашей работы, не показал какой-либо неспецифической амплификации в течение 120-минутной инкубации (рис. 2B), за исключением анализов, в которых бетаин удалялся из реакции (S6, рис. ).Другие исследовательские группы также сообщили об отсутствии неспецифической амплификации в LAMP с использованием длительного времени реакции (от 90 до 150 минут) [51, 52]. Повышенная специфичность LAMP по сравнению с RPA, вероятно, является результатом шести сайтов связывания праймера LAMP и более высоких температур реакции, которые помогают улучшить специфичность связывания праймера [14].

Мы подтвердили, что время добавления Mg ²⁺ имеет решающее значение для успешной амплификации RPA, поскольку задержки во время настройки реакции приведут к аналогичным скоростям амплификации в мишени и контроле воды (рис. 3A и 3C).Магний является важным сопутствующим фактором для ДНК-полимераз [53, 54, 55], и поэтому производитель наборов RPA предлагает добавлять его в реакцию непосредственно перед инкубацией. Большинство компонентов в RPA поставляются производителем в виде лиофилизированных гранул, что позволяет брать компоненты на место без охлаждения, что идеально подходит для приложений PON. Однако требование пипетки небольшого объема ацетата магния для реакции RPA непосредственно перед инкубацией не является идеальным для приложений PON и, учитывая строгие временные требования RPA, увеличивает риск неправильной интерпретации результата амплификации.

Основным преимуществом RPA перед LAMP является его скорость, таким образом, чтобы повысить скорость усиления LAMP, мы исследовали влияние дополнительных компонентов на скорость усиления LAMP. Мы обнаружили, что ранее сообщаемое увеличение скорости амплификации LAMP в присутствии RecA и ATP [41] было в значительной степени связано с присутствием ATP, а не RecA (рис. 4B). Подобные улучшения амплификации были также достигнуты с использованием дополнительных dNTP; однако чрезмерное количество АТФ или дНТФ (> 6 мМ) оказывало негативное влияние на реакцию LAMP (рис. 4D, 4E и 4F).Это явление, вероятно, связано с секвестрацией свободных ионов Mg ²⁺ избытком отрицательно заряженных нуклеотидов (АТФ и dNTP). Магний необходим для амплификации ДНК, поскольку он необходим для функции ДНК-полимеразы, а также снижает силы отталкивания между праймерами и матрицей ДНК или между цепями ДНК из-за их отрицательно заряженного фосфатного остова [56]. Таким образом, умеренная секвестрация Mg ²⁺ дНТФ, вероятно, приведет к увеличению количества локализованных разделений цепей ДНК [57, 58], облегчая начало амплификации LAMP, в то время как чрезмерное добавление нуклеотидов снизит уровни свободного Mg ^{. 2+} до уровней, при которых активность ДНК-полимеразы ингибируется.В соответствии с этой гипотезой мы обнаружили, что когда количество dNTP в реакции LAMP увеличивается, для успешной амплификации требуется дополнительный магний (рис. 4E и 4F).

Скорость амплификации LAMP может быть дополнительно увеличена путем добавления праймеров петли [35] и праймеров роя [36]. Добавление петлевых праймеров резко сократило время, необходимое для реакции LAMP, чтобы достичь порога флуоресценции, на 76% (с 33 до 8 минут) (рис. 4G), что близко к скорости амплификации RPA (рис. 2A).Однако создание петлевых праймеров не всегда возможно, поскольку целевая последовательность может не иметь пробелов для размещения петлевых праймеров. Кроме того, присутствие праймеров петли может приводить к образованию димеров праймеров. Хотя праймеры роя были менее эффективны, чем праймеры петли (рис. 4G), конструирование праймеров роя намного проще и, как правило, не дает димера праймера. Включение АТФ в реакции с праймерами роя еще больше ускоряет амплификацию (рис. 4G), что может служить полезным альтернативным вариантом, когда праймеры петли не могут быть разработаны.

Самовсасывающая система амплификации LAMP приводит к высокой активности ДНК-полимеразы, которая была использована для разработки ряда простых методов обнаружения ампликонов, которые потенциально подходят для приложений PON. Во время LAMP-амплификации большое количество пирофосфата ((P ₂ O ₇) ^4-) вырабатывается как побочный продукт амплификации ДНК [34]. Комбинация магния и пирофосфата образует нерастворимый осадок пирофосфата магния, который по мере накопления делает реакцию мутной.Это увеличение мутности позволяет пользователю визуально или электронным способом определить, был ли произведен ампликон [31, 53, 54, 55]. Также было разработано несколько колориметрических анализов для LAMP [31, 59–61], позволяющих невооруженным глазом определять успешную амплификацию. Как и RPA, амплификацию LAMP также можно контролировать с помощью флуоресцентных красителей или меченых зондов в сочетании с портативными устройствами количественного определения в реальном времени [26, 62], которые подходят для приложений PON.

Выводы

Наше прямое сравнение нескольких технологий изотермического усиления показало, что LAMP и RPA — лучший выбор для приложений PON.Для реакций RPA требуется специальный зонд-мишень, чтобы различать положительные и отрицательные образцы из-за большого количества неспецифической амплификации. Для LAMP сложная конструкция праймеров является основным недостатком, однако, как мы продемонстрировали здесь, после разработки надежного набора праймеров LAMP сравнима с RPA с точки зрения чувствительности и скорости амплификации (в сочетании с праймерами петель) и не вызывает неспецифической амплификации. Комбинация этих двух изотермических технологий и их портативных методов считывания амплификации с простыми технологиями очистки нуклеиновых кислот [31, 63, 64] обеспечивает практические средства для проведения диагностики на месте и устраняет необходимость транспортировки образцов в лабораторию для анализа.Однако в условиях ограниченных ресурсов, когда измерение амплификации по флуоресценции невозможно / практически невозможно, LAMP является идеальным методом для создания надежных и недорогих диагностических тестов.

Дополнительная информация

S1 Рис. Праймеры для изотермических усилительных технологий.

Праймеры были упрощены в виде линий со стрелками, указывающими направление от 5 ’к 3’. Праймеры, обозначенные зеленой, синей и красной линиями, нацелены на зеленый, синий и красный фрагменты шаблона соответственно.Все остальные праймеры были выровнены с их соответствующими целевыми областями. В SEA и RPA используются один прямой (F) и один обратный (R) праймеры. Праймеры LAMP содержат один прямой (F3), один задний (B3) и два гибридных праймера (FIP и BIP), нацеленных на четыре разные области матрицы. Праймеры PSR содержат два гибридных праймера (Ft и Bt) с обратными друг к другу последовательностями на 5 ’конце и два внутренних праймера (IF и IB) для усиления амплификации. CPA содержит четыре нормальных праймера (4s, 3a, 2a и 5a) и один гибридный праймер (2s), последовательность которого на 5 ’конце совпадает с одним нормальным праймером (2a).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.s001

(TIF)

S2 Рис. Идентификация праймера. Праймеры

( A ) RPA или ( B ) LAMP были добавлены в соответствующие полные реакции для проверки способности амплифицировать ДНК-мишень. ( C ) Дополнительные внутренние праймеры PSR были добавлены в реакции PSR, которые были обозначены знаком «+». Реакции PSR без внутренних праймеров были помечены знаком «-». Мишень, целевая ДНК. Вода, водный контроль. Три панели на S2 Фиг. Получены из трех различных необработанных изображений геля (S1 Raw Images).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.s002

(TIF)

S3 Рис. Улучшение праймеров CPA.

( A ) Праймеры оригинального метода были разработаны, как описано в исходной публикации [15], и добавлены в основную реакционную смесь CPA. 10 мкл реакции CPA из мастер-микса использовали для проверки эффективности праймеров путем добавления целевой ДНК или воды.( B ) На диаграмме показаны названия и целевые области двух наборов праймеров CPA либо из исходного метода, либо из модифицированного метода. Каждый праймер был упрощен в виде одной стрелки с направлением, указывающим направление 5’-3 ’. 5 ’конец праймера 1s (красная линия) имеет ту же последовательность с праймером 2a (красная стрелка) и нацелен на тот же участок (красный фрагмент в матрице) с 2a. Праймеры модифицированного метода получали путем замены праймера 2a на праймер 6s. ( C ) Очищенную целевую ДНК или воду добавляли в 10 мкл реакционной смеси CPA из той же основной смеси, содержащей праймеры модифицированного метода.Изображения S3C Fig были созданы из того же изображения геля, но перестроены для удаления нерелевантных полос. Панели (A) и (C) получены из различных изображений сырого геля.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.s003

(TIF)

S4 Рис. Неспецифические ампликоны, полученные при амплификации RPA.

1 нг F . oxysporum ДНК использовали в качестве целевой ДНК в реакциях для получения целевых ампликонов размером 200 п.н. 1 нг A . thaliana ДНК использовали в качестве нецелевой ДНК.Реакции после амплификации анализировали на агарозном геле.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.s004

(TIF)

S6 Рис. Ложное усиление контролей воды в LAMP без бетаина. реакции.

В реакции, содержащие бетаин и / или RecA, добавляли воду. 1 нг F . oxysporum (целевая ДНК) добавляли в реакцию без бетаина и RecA в качестве положительного контроля. Изображения на каждой панели были созданы из одного и того же необработанного изображения геля, но перегруппированы для удаления нерелевантных полос в соответствующих изображениях геля (S1 Raw Images).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235216.s006

(TIF)

Благодарности

Ипин Цзоу хотел бы поблагодарить Совет по стипендиям Китая и Университет Квинсленда за предоставление стипендии доктора философии.

Ссылки

1. Доносо А., Валенсуэла С. Полевая молекулярная диагностика патогенов растений: последние тенденции и перспективы на будущее. Завод Патол. 2018.
2. Clerc O, Greub G. Регулярное использование тестов в местах оказания медицинской помощи: полезность и применение в клинической микробиологии.Clin Microbiol Infect. 2010. 16 (8): 1054–61. pmid: 20670287
3. Ягер П., Доминго Г. Дж., Гердес Дж. Диагностика в местах оказания медицинской помощи для глобального здравоохранения. Annu Rev Biomed Eng. 2008; 10.
4. Пилинг Р., Мейби Д. Тесты для диагностики инфекций в развивающихся странах. Clin Microbiol Infect. 2010. 16 (8): 1062–9. pmid: 20670288
5. Уорд E, Фостер SJ, Fraaije BA, Mccartney HA. Диагностика патогенов растений: иммунологические подходы и подходы на основе нуклеиновых кислот.Ann Appl Biol. 2004. 145 (1): 1–16.
6. Кроу П., Балачандран В. Технологии изотермической амплификации нуклеиновых кислот для диагностики в местах оказания медицинской помощи: критический обзор. Лабораторный чип. 2012. 12 (14): 2469–86. pmid: 22592150
7. Муллис К., Фалуна Ф., Шарф С., Сайки Р., Хорн Дж., Эрлих Х., редакторы. Специфическая ферментативная амплификация ДНК in vitro: полимеразная цепная реакция. Симпозиумы в Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии; 1986: Лаборатория издательства Колд-Спринг-Харбор.
8. Чжао Ю., Чен Ф, Ли Q, Ван Л., Фан С. Изотермическая амплификация нуклеиновых кислот. Chem Rev.2015; 115 (22): 12491–545. pmid: 26551336
9. Ниемз А., Фергюсон ТМ, Бойл Д.С. Тестирование нуклеиновых кислот на инфекционные заболевания в месте оказания медицинской помощи. Trends Biotechnol. 2011; 29 (5): 240–50. pmid: 21377748
10. Мейсон М.Г., Блэколл П.Дж., Ботелла-младший, Темплтон Дж. М.. Простой в выполнении, бескультурный анализ Campylobacter в точках управления для промышленных предприятий.J Appl Microbiol. 2019.
11. Пател П., Эль-Вахед А.А., Фэй О., Прюгер П., Кайзер М., Талоенгсок С. и др. Полевой анализ амплификации полимеразы рекомбиназы обратной транскрипции для быстрого обнаружения вируса чикунгунья. PLoS Neglected Trop Dis. 2016; 10 (9): e0004953.
12. Lau HY, Wang Y, Wee EJ, Botella JR, Trau M. Демонстрация мультиплексной диагностической платформы для патогенов растений на местах. Anal Chem. 2016. 88 (16): 8074–81. pmid: 27403651
13.Коговшек П., Ходжеттс Дж., Холл Дж., Презель Н., Николич П., Мехле Н. и др. LAMP-анализ и метод быстрой подготовки образцов для обнаружения на месте цветения фитоплазмы dorée в виноградной лозе. Завод Патол. 2015; 64 (2): 286–96. pmid: 26146413
14. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T., Watanabe K, Amino N и др. Петлевая изотермическая амплификация ДНК. Nucleic Acids Res. 2000; 28 (12): e63 – e. pmid: 10871386
15. Xu G, Hu L, Zhong H, Wang H, Yusa S-i, Weiss TC и др.Перекрестная прайминг-амплификация: механизм и оптимизация для изотермической амплификации ДНК. Научный отчет 2012; 2: 246. pmid: 22355758
16. Лю В., Донг Д., Ян З., Цзоу Д., Чен З., Юань Дж. И др. Полимеразная спиральная реакция (PSR): новый метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот. Научный доклад 2015; 5.
17. Shi C, Shang F, Zhou M, Zhang P, Wang Y, Ma C. Инициированная изотермическая ПЦР с помощью денатурационной пузырьковой амплификации с обменом цепей. Chem Commun. 2016; 52 (77): 11551–4.
18. Пипенбург О., Вильямс СН, Стемпл Д.Л., Армес Н.А. Обнаружение ДНК с использованием рекомбинационных белков. PLoS Biol. 2006; 4 (7): e204. pmid: 16756388
19. Yonesaki T, Ryo Y, Minagawa T., Takahashi H. Очистка и некоторые функции продуктов генов рекомбинации бактериофага T4, uvs X и uvs Y. Eur J Biochem. 1985. 148 (1): 127–34. pmid: 3156738
20. Формоза Т, Альбертс Б. Очистка и характеристика белка uvsX бактериофага Т4.J Biol Chem. 1986. 261 (13): 6107–18. pmid: 2939071
21. Винсент М., Сюй И, Конг Х. Изотермическая амплификация ДНК, зависимая от геликазы. EMBO Rep. 2004; 5 (8): 795–800. pmid: 15247927
22. Runyon G, Lohman T. Белок геликазы II Escherichia coli (uvrD) может полностью раскручивать полностью дуплексную линейную и разорванную кольцевую ДНК. J Biol Chem. 1989. 264 (29): 17502–12. pmid: 2529260
23. Корнберг А., Бейкер Т.А. Репликация ДНК: Wh Freeman New York; 1992 г.
24. Карутерс Дж. М., Маккей Д.Б. Строение и механизм геликазы. Curr Opin Struct Biol. 2002. 12 (1): 123–33. pmid: 11839499
25. Синглтон Дж., Осборн Дж. Л., Лиллис Л., Хокинс К., Гелиг Д., Прайс В. и др. Безэлектричество амплификация и обнаружение для молекулярной диагностики ВИЧ-1 в месте оказания медицинской помощи. PloS один. 2014; 9 (11): e113693. pmid: 25426953
26. Ляо С.С., Пэн Дж., Маук М.Г., Авасти С., Сонг Дж., Фридман Х. и др. Умная чашка: мобильное молекулярное диагностическое устройство на базе смартфона с минимальным оснащением.Sens Actuators, B. 2016; 229: 232–8.
27. Нкоуава А., Сако Ю., Ли Т., Чен Х, Накао М., Янагида Т. и др. Петлевой метод изотермической амплификации для дифференциальной идентификации ленточных червей Taenia от человека: приложение к полевому исследованию. Parasitol Int. 2012. 61 (4): 723–5. pmid: 22698671
28. Заноли Л. М., Спото Г. Методы изотермической амплификации для обнаружения нуклеиновых кислот в микрофлюидных устройствах. Биосенсоры. 2013; 3 (1): 18–43. pmid: 25587397
29.Хан М., Ван Р., Ли Б., Лю П., Вен К., Чен К. Сравнительная оценка анализа LAMP и анализов на основе ПЦР для быстрого обнаружения Alternaria solani. Front Microbiol. 2018; 9: 2089. pmid: 30233554
30. Ван X, Сео DJ, Ли М.Х., Чой С. Сравнение обычных ПЦР, мультиплексных ПЦР и петлевых изотермических анализов амплификации для быстрого обнаружения видов Arcobacter. J Clin Microbiol. 2014. 52 (2): 557–63. pmid: 24478488
31. Zou Y, Mason MG, Wang Y, Wee E, Turni C, Blackall PJ и др.Очистка нуклеиновых кислот от растений, животных и микробов менее чем за 30 секунд. PLoS Biol. 2017; 15 (11): e2003916. pmid: 2
68
32. Мейсон М.Г., Ботелла-младший. Простое, надежное считывание результатов амплификации ДНК без использования оборудования менее чем за 30 секунд. RSC Adv. 2019; 9 (42): 24440–50.
33. Аллен Г., Флорес-Вергара М., Красинански С., Кумар С., Томпсон В. Модифицированный протокол для быстрого выделения ДНК из тканей растений с использованием бромида цетилтриметиламмония. Nat Protoc.2006; 1 (5): 2320. pmid: 17406474
34. Мори Ю., Нагамин К., Томита Н., Нотоми Т. Обнаружение опосредованной петлей реакции изотермической амплификации по мутности, обусловленной образованием пирофосфата магния. Biochem Biophys Res Commun. 2001. 289 (1): 150–4. pmid: 11708792
35. Nagamine K, Hase T, Notomi T. Ускоренная реакция посредством петлевой изотермической амплификации с использованием петлевых праймеров. Зонды Mol Cell. 2002. 16 (3): 223–229. pmid: 12144774
36. Мартино Р.Л., Мюррей С.А., Си С., Гао В., Чао С. ч., Мелдрам ДР.Повышение эффективности анализов изотермической амплификации, опосредованной петлей, с помощью прайминга Swarm. Anal Chem. 2016; 89 (1): 625–32. pmid: 27809497
37. Walker GT, Fraiser MS, Schram JL, Little MC, Nadeau JG, Malinowski DP. Амплификация замещения цепи — изотермический метод амплификации ДНК in vitro. Nucleic Acids Res. 1992. 20 (7): 1691–6. pmid: 1579461
38. Огонь A, Сюй S-Q. Скручивающаяся репликация коротких кругов ДНК. Proc Natl Acad Sci. 1995. 92 (10): 4641–5.pmid: 7753856
39. Dong D, Zou D, Liu H, Yang Z, Huang S, Liu N и др. Быстрое обнаружение синегнойной палочки, направленной на ген toxA, у пациентов отделения интенсивной терапии из Пекина, Китай. Front Microbiol. 2015; 6.
40. Цзян X, Донг Д., Бянь Л., Цзоу Д., Хе Икс, Ао Д. и др. Быстрое обнаружение Candida albicans методом полимеразной спиральной реакции в клинических образцах крови. Front Microbiol. 2016; 7.
41. Мицунага С., Симидзу С., Окудаира Ю., Ока А., Танака М., Кимура М. и др.Улучшенная изотермическая амплификация, опосредованная петлями, для генотипирования HLA-DRB1 с использованием RecA и рестрикционного фермента для повышения специфичности амплификации. Иммуногенетика. 2013. 65 (6): 405–15. pmid: 23474534
42. Ма Ц., Ван И, Чжан П., Ши С. Ускоренная изотермическая амплификация нуклеиновых кислот в реакции без бетаина. Анальная биохимия. 2017; 530: 1–4. pmid: 28457896
43. Овчарзи Р., Татауров А.В., Ву Й., Манти Дж. А., Маккуистен К. А., Альмабрази Х. Г. и др. IDT SciTools: набор для анализа и дизайна олигомеров нуклеиновых кислот.Nucleic Acids Res. 2008; 36 (допл_2): W163 – W9.
44. Эбишер А., Вернике К., Хоффманн Б., Бир М. Быстрое определение генома вируса Шмалленберга и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота с использованием методов изотермической амплификации и высокоскоростной ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени. J Clin Microbiol. 2014; 52 (6): 1883–92. pmid: 24648561
45. Ким Н-И, О Дж, Ли С-Х, Ким Х, Мун Дж.С., Чон Р-Д. Быстрое и специфическое обнаружение вируса бороздки стебля яблони путем амплификации полимеразы рекомбиназы с обратной транскрипцией. Журнал патологии растений. 2018; 34 (6): 575. pmid: 30588230
46. Юлия Л., Бьянка И.М., Корнелия О., Октавиан П. Доказательства контаминантной бактериальной ДНК в нескольких коммерческих полимеразах Taq. Biotechnol Lett. 2013; 18: 8007–12.
47. Уилсон И.Г. Подавление и облегчение амплификации нуклеиновых кислот. Appl Environ Microbiol. 1997; 63 (10): 3741. pmid: 9327537
48. Wand NIV, Bonney LC, Watson RJ, Graham V, Hewson R. Диагностический анализ на месте для обнаружения вируса Зика с использованием метода амплификации рекомбиназной полимеразы.Журнал общей вирусологии. 2018; 99 (8): 1012. pmid: 29897329
49. Россер А., Роллинсон Д., Форрест М., Вебстер Б. Изотермическая рекомбиназная полимераза-амплификация (RPA) ДНК Schistosoma haematobium и обнаружение олигохроматографического бокового потока. Векторы паразитов. 2015; 8 (1): 446.
50. Ахмед Ф.А., Ларреа-Сармьенто А., Альварес А. М., Ариф М. Диагностика с учетом генома для специфического и быстрого обнаружения видов Pectobacterium с использованием амплификации рекомбиназной полимеразы в сочетании с устройством бокового потока.Научный доклад 2018; 8 (1): 1–11.
51. Шил CM, Чжоу Й., Теодоро Р.С., Абрамс Б., Баладжи С.А., Литвинцева А.П. Разработка метода петлевой изотермической амплификации для обнаружения ДНК Histoplasma capsulatum в клинических образцах. J Clin Microbiol. 2014; 52 (2): 483–8. pmid: 24478477
52. да Силва Гонсалвеш D, Кассимиро АПА, де Оливейра CD, Родригес Н.Б., Морейра Л.А. Обнаружение вольбахии у насекомых с помощью LAMP: петлевой изотермической амплификации. Векторы паразитов.2014; 7 (1): 228.
53. Гото М., Хонда Е., Огура А., Номото А., Ханаки К. Колориметрическое определение опосредованной петлей реакции изотермической амплификации с использованием гидроксинафтолового синего. Биотехники. 2009. 46 (3): 167–72. pmid: 19317660.
54. Tomita N, Mori Y, Kanda H, Notomi T. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) генных последовательностей и простое визуальное обнаружение продуктов. Nat Protoc. 2008; 3 (5): 877. pmid: 18451795
55. Ви Э, Лау Х, Ботелла Дж, Трау М.Переназначение промежуточной флокуляции для быстрого и качественного обнаружения ДНК на месте в условиях ограниченных ресурсов. Chem Commun. 2015. 51 (27): 5828–31.
56. Маркулатос П., Сиафакас Н., Монкани М. Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход. Анал J Clin Lab. 2002. 16 (1): 47–51. pmid: 11835531
57. Алтан-Бонне Г., Либхабер А., Кричевский О. Динамика пузырей в двухцепочечной ДНК. Phys Rev Lett. 2003; 90 (13): 138101. pmid: 12689326
58. Цзян И, Ли Б., Миллиган Дж., Бхадра С., Эллингтон А. Д..Обнаружение в реальном времени изотермических реакций амплификации с помощью термостабильной каталитической шпильки. J Am Chem Soc. 2013. 135 (20): 7430–3. pmid: 23647466
59. Миямото С., Сано С., Такахаши К., Джикихара Т. Метод колориметрического обнаружения двухцепочечной нуклеиновой кислоты с использованием лейкотрифенилметановых красителей. Анальная биохимия. 2015; 473: 28–33. pmid: 25575759
60. Таннер Н.А., Чжан Ю., Эванс Т.С. младший. Визуальное обнаружение изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием pH-чувствительных красителей.Биотехники. 2015. 58 (2): 59–68. pmid: 25652028
61. Хилл Дж., Беривал С., Чандра I, Пол В.К., Капил А., Сингх Т. и др. Петлевой изотермический анализ амплификации для быстрого обнаружения распространенных штаммов Escherichia coli. J Clin Microbiol. 2008. 46 (8): 2800–4. pmid: 18550738
62. Лю Ч., Гева Э., Маук М., Цю Х, Абрамс В. Р., Маламуд Д. и др. Реактор изотермической амплификации со встроенной изолирующей мембраной для выявления инфекционных заболеваний на месте.Аналитик. 2011; 136 (10): 2069–76. pmid: 21455542
63. Томлинсон Дж., Дикинсон М., Хобден Э., Робинсон С., Гилтрап П., Бунхэм Н. Пятиминутный метод экстракции ДНК для ускоренного обнаружения Phytophthora ramorum после предварительного отбора с использованием Phytophthora spp. устройства с боковым потоком. J Microbiol Methods. 2010. 81 (2): 116–20. pmid: 20171248
64. Макфолл С.М., Вагнер Р.Л., Джангам С.Р., Ямада Д.Х., Харди Д., Келсо Д.М. Простой и быстрый метод экстракции ДНК из цельной крови для высокочувствительного обнаружения и количественного определения провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью ПЦР в реальном времени.J Virol Methods. 2015; 214: 37–42. pmid: 25681524

вакцин HER2-LAMP эффективно перемещаются в эндолизосомные компартменты и генерируют усиленные полифункциональные Т-клеточные ответы, которые вызывают полную регрессию опухоли

Введение

Примерно ~ 20% всех случаев рака молочной железы (РМЖ) характеризуются сверхэкспрессией онкогенного рецептора эпидермального фактора роста человека. 2 (HER2), который играет решающую роль в трансформации и поддержании этих видов рака.1–3 Расширенные БК HER2 + можно лечить с помощью комбинации химиотерапии и HER2-специфических моноклональных антител (mAb), но это не лечение метастатического HER2 + BC.1 2 Дополнительные целевые методы лечения HER2 (например, низкомолекулярные ингибиторы и HER2) Конъюгат антитела и лекарственного средства, T-DM1) также эффективен при метастатическом HER2 + BC, но не является лечебным, поэтому необходимы более эффективные методы лечения HER2 + BC.1 4 Хотя потеря или мутация антигена являются известными механизмами терапевтической устойчивости, онкогенная экспрессия HER2 остается повышенной при устойчивых к терапии раковых опухолях и имеет решающее значение для их непрерывного роста, что делает HER2 неотразимой иммунологической мишенью.1 2 5 В наших предыдущих исследованиях мы разработали HER2-специфические вирусные вакцины, кодирующие инактивированные и укороченные формы HER26 7, которые мы использовали для стимуляции HER2-специфических иммунных ответов у пациентов с распространенным HER2 + BC. 6 Эти исследования продемонстрировали, что вирусные вакцины, кодирующие укороченные формы HER2 может нарушить HER2-специфическую толерантность у HER2 + пациентов с РМЖ с индукцией значительных HER2-специфических Т-клеточных ответов памяти у части пациентов. Примечательно, что мы обнаружили, что эти HER2-специфические реакции памяти были связаны с повышенной выживаемостью без прогрессирования заболевания.6 Поскольку HER2-специфические иммунные ответы наблюдались только у части пациентов, мы хотели изучить стратегии усиления иммунных ответов на HER2 и рассмотрели генетические модификации нашей вакцины.

Одна генетическая стратегия для усиления индуцированных вакциной, антиген-специфических Т-клеточных ответов заключается в изменении доставки антигена в различные субклеточные компартменты. 8-10 Ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1 (LAMP1) представляет собой мембранный белок 1 типа, обладающий коротким цитозольным C -конце, содержащее эндолизосомную нацеливающую последовательность. Нацеливание на антиген LAMP — это средство направления экспрессируемых антигенов, содержащих сигналы переноса LAMP, в эндолизосомные компартменты и усиления презентации пути MHC класса II.11 12 Транспорт антигена LAMP позволяет обойти ограничение всех неэкспортированных белков из вирусных и плазмидных вакцин, направляемых в класс MHC I и усиливает презентацию MHC класса II и последующую стимуляцию CD4 + T-клеточных и B-клеточных ответов.11 13 Поскольку презентация MHC класса II связана с эффективным противоопухолевым иммунитетом14, а CD4 + T-клеточные ответы связаны с HER2-специфическими противоопухолевыми ответами, 15–18 Вакцины на основе LAMP имеют большой потенциал для использования против HER2 и других раковых антигенов.Однако вакцины на основе LAMP в основном используются для борьбы с патогенами, включая ВИЧ, ВПЧ, цитомегаловирус (ЦМВ), вирус Западного Нила, атипичную пневмонию, хантавирус и вирус денге.11 12 19–24 В совокупности эти исследования продемонстрировали повышенную способность к заражению. LAMP-вакцины для презентации антигенов через путь MHC класса II, что приводит к улучшенным патоген-специфическим иммунным ответам. Более поздние исследования использовали вакцины на основе LAMP для искажения иммунных ответов на определенные аллергены, такие как белок Crly2 из пыльцы японского красного кедра, в сторону неаллергического ответа Th2 в качестве средства подавления выработки IgE.25 26 В совокупности эти исследования предполагают, что интеграция нацеливания LAMP в вакцины HER2 может усилить индукцию HER2-специфических ответов Th2 CD4 Т-клеток, что может привести к более эффективному противоопухолевому иммунитету. Однако было неясно, может ли этой стратегии препятствовать потенциально измененная или подавленная презентация через путь MHC класса I, или будет ли она достаточно эффективна против непатогенных антигенов (которые подвержены иммунной толерантности) для индукции противоопухолевого иммунитета.

В дополнение к усилению представления MHC класса II, дополнительным преимуществом нацеливания на антиген является возможность включения в несколько векторных платформ, которые имеют установленные профили продукции и безопасности, без необходимости оценивать различные экспериментальные адъюванты или новые векторные платформы. В прошлом мы исследовали использование транспорта экзосомальных антигенов и обнаружили, что, хотя он усиливает Т-клеточные и В-клеточные ответы на определенные антигены, такие как карциноэмбриональный антиген, он не сильно усиливает ответы по сравнению с полноразмерными или укороченными формами HER2.8 Благодаря нашему клиническому успеху вакцинации против HER2, 6 мы исследовали эндолизосомный перенос вакцины HER2 посредством включения мотивов переноса LAMP в конструкцию HER2, содержащую как внеклеточные, так и внутриклеточные домены (ECD / ICD) рецептора. Наши исследования показали, что HER2-LAMP усиливает эндолизосомный транспорт HER2 по сравнению с HER2-WT, что приводит к значительному снижению экспрессии HER2 и усилению как MHC класса I, так и II презентации LAMP-слитых пептидов.Эта модификация позволила более раннее размножение как антиген-специфических CD4 +, так и CD8 + Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах, что транслировалось в более сильные системные иммунные ответы, о чем свидетельствует превосходная индукция полифункциональных HER2-специфических Т-клеток после вакцинации HER2-LAMP. Повышенное количество и качество HER2-специфических Т-клеточных ответов после вакцинации HER2-LAMP позволило обеспечить более эффективный противоопухолевый иммунитет, зависящий от CD4 + и CD8 + Т-клеток. Важно отметить, что вакцины HER2-LAMP вызвали значительно усиленный противоопухолевый ответ против аутоантигенов HER2, что привело к полной регрессии опухоли в агрессивной эндогенной модели HER2 + BC у значительной части мышей (~ 30%).Эта регрессия была связана с большей активацией CD4 + и CD8 + Т-клеток в опухолях мышей, вакцинированных HER2-LAMP, по сравнению с опухолями от мышей, вакцинированных HER2-WT. Таким образом, наше исследование демонстрирует, что транспорт антигена LAMP может усиливать Т-клеточные ответы, продуцируя увеличенные мультипотентные HER2-специфические Т-клетки, которые обеспечивают эффективный противоопухолевый иммунитет в модели расширенного HER2 + BC.

Материалы и методы

Мыши

Самки BALB / c, C57BL / 6, OTI, OTII, MHCI — / -, MHCII — / — и HLA2. 1 были приобретены в Jackson Labs и выведены в Duke в соответствии с комитетом Duke Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Эндогенная модель HER2 + BC была любезным подарком от Уильяма Мюллера (Университет Макгилла) 27. Все протоколы исследований с участием мышей выполнялись в соответствии с рекомендациями IACUC.

Конструкция вектора

ДНК-вакцины, кодирующие HER2 + LAMP и куриный овальбумин (OVA) + LAMP, были созданы в Nature Technology Corporation (NTC, Lincoln, Nebraska, USA).Кодон гена HER2 был оптимизирован для использования человеком с использованием программного обеспечения для онлайн-дизайна генов GeneArt / Invitrogen. Синтетические гены были произведены GeneArt / Invitrogen (Life Technologies, Grand Island, New York, USA). Конструкцию HER2 / LAMP получали путем вставки последовательности HER2 между люминальным доменом (Xho1) и трансмембранным / цитоплазматическим доменом (EcoR1) LAMP в векторе экспрессии NTC8382-VA1. NTC8382-VA1 представляет собой ковалентно замкнутый кольцевой двухцепочечный плазмидный вектор. Фланкирующие области сайта вставки представляют собой эукариотический промотор (CMV) и терминатор транскрипции поли-A, которые фланкируют сайт вставки для экспрессии слитых белков LAMP в клетках-мишенях.Плазмиду трансформировали в компетентные клетки линии клеток-хозяев NTC4862 и отбирали по устойчивости к сахарозе.

Плазмидные вакцинации

Внутримышечные вакцинации, требующие однократной дозы, выполнялись с использованием системы электропорации BTX ECM 830, в то время как внутримышечные вакцинации, требующие нескольких доз, выполнялись с использованием системы доставки ICHOR TriGrid, адаптированной для доставки вакцины мышам. Правое бедро брили, стерилизовали 70% этанолом и вводили вакцину с последующей электропорацией через 5 секунд с использованием запатентованных настроек электрического импульса ICHOR.В случае нескольких бустеров та же процедура электропорации была проведена на чередующихся бедрах, то есть на правом бедре на 0 день, левом бедре на 7 день и правом бедре на 14 день. Иммунологические тесты (анализ сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), ELISPOT интерферона-γ (IFNγ), ELISA на HER2-специфических клетках) проводили через 7 дней после последней повторной иммунизации в каждом эксперименте.

Внутрикожные вакцинации выполняли путем инъекции ДНК в объеме 20 мкл в вентральную поверхность уха с последующей электропорацией в месте инъекции с использованием системы ICHOR.Иммунологические тесты проводились через 7 дней после последней повторной стимуляции каждого эксперимента.

Ортотопическая трансплантация и истощение антител

Мышам BALB / c инъецировали клетки TSA (американская коллекция типовых культур (ATCC)), которые стабильно трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим ген ErBB2 человека дикого типа. CD4 против мыши (клон GK1.5), CD8 против мыши (клон 2,43) и IgG изотипического контроля были приобретены у Bio X Cell. У мышей истощались субпопуляции Т-клеток in vivo путем внутрибрюшинной инъекции 250 мкг анти-CD4 (GK1. 5) или анти-CD8 (2,43) mAb на -3, 1, 5, 8 и два раза в неделю после инъекции опухоли. 100% успешная имплантация наблюдалась для всех моделей во всех группах лечения, за исключением 1 мыши, вакцинированной HER2-LAMP в модели индукции.

ELISPOT-анализ мышиного IFNγ

Мышиные спленоциты (500 000–1 000 000 клеток / лунка) выделяли и стимулировали в среде RPMI1640 с 10% FBS в течение 24–48 часов следующими пептидами: пептиды, объединенные с HER2 ICD (1 мкг / мл; JPT ), Объединенные пептиды HER2 ECD (1 мкг / мл; JPT), смесь нерелевантных пептидов HIV-gag (1 мкг / мл: JPT) или PMA (50 нг / мл) и иономицин (1 мкг / мл; Sigma) в качестве положительных контролей. .Пептид HER2 ECD и ICD, используемые в анализе ELISPOT, были в соотношении 1: 1. Использовали набор для анализа IFNγ ELISPOT (Mabtech).

ELISA на основе клеток анти-HER2-антител

Сыворотку вакцинированных мышей разбавляли и добавляли к родительским или человеческим HER2-экспрессирующим клеткам NMUMG в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали и клетки фиксировали 1% формалином. Вторичное антимышиное антитело, конъюгированное с IgG-HRP (Cell Signaling Technology), использовали перед проявкой с субстратом 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин (TMB) (Biolegend) и оптической плотностью, определяемой с помощью ридера для микропланшетов Bio-Rad Model 680 ( Био-Рад).

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки 293T, E0771 и JAWSII выращивали на 8-луночных предметных стеклах (MatTek), покрытых 1 мкг / мл фибронектина человека (EMD Millipore). Трансфекцию проводили с использованием Lipofectamine3000 (Thermofisher). Для окрашивания Lysotracker (ThermoFisher) клетки инкубировали с Lysotracker 75 нм в течение 1 часа при 37 ° C. Для окрашивания эндоплазматического ретикулума (ER) клетки инкубировали с 2 мкл ER CellLight ER-RFP Bacman V.2.0 (Thermofisher) в течение 24 часов. Предметные стекла промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 10% формалином в течение 20 минут и устанавливали с помощью DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech). Окрашивание проводили в 0,1% PBST с кроличьими анти-HER2 (1: 200, Cell Signaling), крысиными анти-LAMP1 (1: 200, Abcam) или крысиными анти-MHCII (1: 200, Thermofisher) при 4 ° в течение ночи и анти-кроличьими. Alexa Fluor 488 (разведение 1: 1000, Invitrogen) или antirat Texas Red-X (1: 1000, invitrogen) при комнатной температуре в течение 1 часа. Слайды монтировали с помощью Fluoromount-G с DAPI (Southern Biotech).

Вестерн-блоттинг

Клетки тканевой культуры собирали и лизировали с использованием буфера RIPA. Общий лизат (20 мкг) наносили на гель с использованием системы Biorad Mini-PROTEAN с последующим переносом с использованием системы полусухого переноса Biorad.В качестве первичных используемых антител были кроличьи анти-HER2 (1: 1000, Cell Signaling), мышиные анти-OVA (1: 1000, Abcam) или кроличьи анти-GAPDH (1: 1000, Cell Signaling). Antirabbit IRDye 800 (1: 1000, LICOR) и antimouse IRDye 680 (1: 1000, LICOR) использовали в качестве вторичных веществ. Блокирование, зондирование, визуализация и количественная оценка были выполнены в соответствии со спецификациями системы LI-COR Odyssey.

Проточная цитометрия

Для проточной цитометрии клеток тканевой культуры клетки выделяли из селезенки мыши и механически диссоциировали с помощью сетчатого фильтра для клеток 40 мкм (Greiner Bio-One).Эритроциты лизировали буфером для лизиса эритроцитов (Sigma). Клетки метили аква-красителем живой / мертвой жизнеспособности в PBS (1: 500), затем поверхностными антителами (1: 100) в буфере для окрашивания (1% BSA, 1% крысиная сыворотка в PBS). Антитела, используемые для окрашивания поверхности: PE / Dazzle анти-CD4 (RM4-5, Biolegend), APC / CY7 анти-CD8 (YTS156.7.7, Biolegend), PE / CY7 анти-CD44 (IM7, Biolegend), анти-CD69 ( h2.2F3, BD Bioscience). Для внутриклеточного окрашивания клетки окрашивали живым / мертвым красителем цвета морской волны с последующим окрашиванием поверхности, фиксацией раствором для перманентной / фиксации (Thermofisher) и окрашивали внутриклеточными антителами против FITC anti-IFNγ (XMG1.2, Invitrogen) и противоопухолевый фактор некроза опухолей α (TNFα) AF647 (MP6-XT22, Biolegend) в 1 х перманентном / промывном буфере. Клетки промывали и анализировали на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo.

Статистический анализ

Статистический анализ всех экспериментов проводился с указанными статистическими тестами с использованием программного обеспечения Graphpad Prism. Данные представляют собой средние значения ± SEM объемы опухоли, данные проточной цитометрии, ELISA и ELISPOT из экспериментов с тремя или более группами лечения были проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа с помощью теста множественных сравнений Бонферрони.Двусторонний непарный t-критерий Стьюдента использовался для экспериментов только с двумя группами. Объемы опухолей анализировали только в конечной конечной точке, если не указано иное. Статистический анализ проводился с помощью Prism (GraphPad). Статистически значимыми считались значения P 0,05 или меньше. *, р <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001. Статистические тесты: двусторонний t-критерий Стьюдента. * р <0,05, ** р <0,01.

Результаты

Генерация ламповых векторов с измененным переносом и экспрессией антигенов

Как показали предыдущие исследования, антигены, передаваемые через LAMP1, могут изменять ответы на инфекционное заболевание и аллергию, 11 13 23 24 26 28–30 мы хотели определить, является ли эта стратегия может изменять иммунные ответы на признанные эндогенные опухолевые антигены, такие как HER2.Чтобы сначала проверить измененный трафик, мы сгенерировали серию LAMP-нацеленных и контрольных конструкций, добавив сигнальную последовательность LAMP к N-концу и LAMP ICD к C-концу (рисунок 1A). Эти гены клонировали в плазмиды экспрессии промотора CMV и трансфицировали для оценки субклеточной локализации и транспорта с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. В этих экспериментах мы отметили измененную локализацию HER2-LAMP в трансфицированных 293 Т-клетках, что проиллюстрировано более внутриклеточным распределением в отличие от обогащенного мембраной распределения в нативных трансфицированных HER2-WT клетках (рисунок 1B). Исследования совместной локализации показали, что HER2-LAMP значительно колокализуется с нативным LAMP1 (рисунок 1C), лизосомами (рисунок 1D) и ER (рисунок 1E) по сравнению с HER2-WT. Чтобы определить, зависит ли этот измененный трафик от трансгена или типа клетки, мы трансфицировали OTI / II-GFP-LAMP и GFP в линию дендритных клеток (DC) JAWSII. Исследования совместной локализации этих клеток снова показали, что OTI / II-GFP-LAMP совместно локализуется с нативным LAMP1 (рисунок 1F), лизосомами (рисунок 1G) и MHC класса II (рисунок 1H) по сравнению с контролем OTI / II-GFP.Чтобы подтвердить измененный перенос HER2 на клеточную поверхность, мы также выполнили проточную цитометрию на клетках 293T и RAW264.7 (макрофаги), трансфицированных HER2-WT или HER2-LAMP (рис. 1I, дополнительный онлайн-S1A). Мы обнаружили, что в обоих типах клеток HER2-LAMP имеет пониженную экспрессию на клеточной поверхности по сравнению с HER2-WT. В нашей микроскопии и экспериментах на основе потока мы также наблюдали, что векторы LAMP снизили общую интенсивность экспрессии антигена по сравнению с контрольными аналогами. Чтобы проверить, приводит ли этот измененный трафик к снижению экспрессии белка, мы выполнили вестерн-блоттинг клеток, трансфицированных HER2 и HER2-LAMP, а также клеток, трансфицированных OVA-WT и OVA-LAMP (рис. 1J – K).Мы обнаружили, что, хотя мы могли обнаружить оба белка с помощью вестерн-блоттинга, гены, нацеленные на LAMP, имели значительно сниженные уровни экспрессии белка. Впоследствии мы подтвердили это с помощью проточной цитометрии в векторах GFP-WT и GFP-LAMP, а также по показаниям активности люциферазы в клетках, трансфицированных векторами люциферазы дикого типа (LUC-WT) и векторами LUC-LAMP (онлайн-дополнительный рисунок S1B – C). ). Для каждого антигена и стратегии обнаружения мы наблюдали значительно сниженную экспрессию вариантов LAMP, предполагая, что измененный перенос клеток в лизосомы приводит к различиям в экспрессии, которые могут способствовать презентации антигена и приводить к измененному антиген-специфическому иммунитету.

Рисунок 1

Измененный трафик и экспрессия антигена через LAMP. (A) Графические изображения плазмид ДНК HER2-LAMP, OTI / OTII-GFP-LAMP и OVA-LAMP. (B) Субклеточное распределение HER2 в клетках 293T, трансфицированных HER2-WT или HER2-LAMP, по данным иммунофлуоресцентной микроскопии, n = 3 (C) Совместная локализация HER2 с эндогенным LAMP-1 n = 5, Lysotracker (D) n = 5 и CellLight ER (E) n = 4 маркера в клетках 293T, трансфицированных HER2-WT или HER2-LAMP, вместе с их соответствующей количественной оценкой колокализации, нормализованной по общей экспрессии HER2.(F) Совместная локализация GFP с эндогенными маркерами LAMP-1 n = 6, Lysotracker (G) n = 6 и MHCII (H) n = 5 в клетках JAWSII, стабильно трансдуцированных OTI / OTII-EGFP или OTI / OTII-EGFP-LAMP , наряду с их соответствующей количественной оценкой совместной локализации, нормализованной по общей экспрессии EGFP. (I) Проточно-цитометрический анализ поверхностной экспрессии HER2 клеток 293T, трансфицированных HER2-WT или HER2-LAMP, n = 3. (J) Вестерн-блоттинг экспрессии HER2 клеток 293T, трансфицированных HER2-WT или HER2-LAMP с их соответствующей количественной оценкой, n = 3 (K) Вестерн-блот экспрессии OVA клеток 293T, трансфицированных OVA-WT или OVA-LAMP их соответствующее количественное определение, n = 3. ER, эндоплазматический ретикулум; HER2, рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; LAMP, мембрана, ассоциированная с лизосомами; OVA, овальбумин. T-критерий Стьюдента. * р <0,05, ** р <0,01.

Вакцинация антиген-направленными ламповыми векторами вызывает значительно усиленные антиген-специфические Т-клеточные ответы, но более слабые В-клеточные ответы

in vivo

Чтобы определить, изменяет ли нацеливание LAMP на Т-клеточно-специфический иммунитет к опухолевым антигенам путем вакцинации в клинически значимых Мы сначала исследовали иммунные ответы в C57BL / 6-hHLA-2.1, которые экспрессируют молекулу HLA-2.1 человека для презентации антигена. Мы вакцинировали этих мышей с помощью внутримышечной электропорации плазмидами HER2-WT или HER2-LAMP и оценили HER2-специфические иммунные ответы (рис. 2A). Спленоциты вакцинированных мышей рестимулировали пептидами HER2 ECD и ICD, а продукцию IFNγ измеряли с помощью ELISPOT. Векторы HER2-LAMP вызывали значительно усиленные HER2-специфические Т-клеточные ответы (фиг. 2B), но не HER2-специфические ответы антител на HER2 ECD (онлайн-дополнительная фигура S2A).Чтобы подтвердить, что на эти усиленные ответы на HER2 не повлияла передача сигналов HER2 от нашей контрольной плазмиды (содержащей полноразмерный HER2) или исключительно из-за нашего специфического типа электропорации, мы снова повторили стратегию внутримышечной электропорации (с использованием однократной вакцинации более высокой интенсивности) с использованием HER2. -ECD-трансмембранная (HER2-ECD-TM) и HER2-LAMP плазмиды и оценивали HER2-ECD-специфические Т-клеточные и В-клеточные ответы. Эти эксперименты показали, что, хотя HER2-ECD-TM также может вызывать устойчивые HER2-ECD-специфические Т-клеточные ответы, HER2-LAMP снова генерирует значительно усиленный HER2-специфический ответ (рисунок 2C).Как и раньше, мы отметили снижение HER2-специфических ответов антител, предполагая, что изменение трафика LAMP могло смещать HER2-специфические иммунные ответы на ответы Th2-типа (онлайн-дополнительный рисунок S2B). Поскольку эти измененные Т-клеточные ответы, вероятно, были смесью представленных пептидов класса I и класса II, мы затем использовали наши плазмиды OTI / II-GFP, чтобы выяснить, можем ли мы специфически изменять специфические пептидные ответы класса I и II, используя пептид-специфические анализы ELISPOT. . Используя ту же стратегию электропорации, мы обнаружили, что векторы OTI / II-EGFP-LAMP позволили значительно усилить ответы IFNγ на пептид класса I SIINFEKL (мишень OTI) и умеренно улучшить ответы IFNγ на пептид класса II ISQVHAAHAEINEAGR (мишень OTII), что предполагает что трафик LAMP может усилить ответы IFNγ против эффекторных CD8 + Т-клеток класса I (фигура 2D).Чтобы дополнительно исследовать эти различия, мы использовали плазмиды HER2-WT и HER2-LAMP с гомологичной стратегией усиления плазмиды с использованием внутрикожной электропорации для специфического обогащения для нацеливания на DC, как описано ранее31–34 (рисунок 2E). Используя эту стратегию, мы снова обнаружили, что векторы HER2-LAMP вызывают значительно усиленные HER2-специфические ответы ELISPOT IFNγ по сравнению с HER2-WT (фигура 2F), наряду со снижением HER2-специфических ответов антител (фигура 2G). Чтобы оценить различия в уровнях полифункциональных HER2-специфических Т-клеток, мы рестимулировали CD8 + и CD4 + Т-клетки вакцинированных мышей пептидами HER2 и окрашивали на внутриклеточный IFNγ и TNFα.Эти эксперименты показали, что, хотя обе вакцины могут стимулировать CD8 + и CD4 + HER2-специфические цитокиновые ответы, векторы HER2-LAMP вызывают большее количество CD8 + Т-клеток, продуцирующих дважды IFNγ / TNFα (рис. 2H), но не влияют на продукцию цитокинов CD4 + Т-клетками. на 28 день после вакцинации (рисунок 2I). Эти данные демонстрируют, что вакцинация векторами для переноса LAMP приводит к усилению антиген-специфических CD8 + Т-клеточных ответов.

Рисунок 2

Усиленные Т-клеточные и В-клеточные иммунные ответы, вызванные вакцинацией HER2-LAMP.(A) Мышей HLA2.1 вакцинировали посредством внутримышечной электропорации с контролем PBS, 40 мкг HER2-WT или 40 мкг HER2-LAMP с двумя гомологичными повторными вакцинациями, вводимыми через 7 и 14 дней после начальной вакцинации. ELISPOT и ELISA проводили через 7 дней после последней вакцинации. (B) ELISPOT, обнаруживающий HER2-специфический ответ IFNγ в спленоцитах вакцинированных мышей HLA2.1, n = 5 (C) ELISPOT, обнаруживающий HER2-специфический ответ IFNγ в спленоцитах мышей C57BL / 6, вакцинированных 50 мкг HER2-ECD или HER2- LAMP, n = 8 (D) ELISPOT, выявляющий антиген-специфический ответ IFNγ в спленоцитах, стимулированных пептидами OVA, ограниченными классом I или классом II, от мышей C57BL / 6, вакцинированных OVA-LAMP, n = 5 (E) Мышей BALB / c вакцинировали с помощью внутрикожная электропорация с 40 мкг контрольного вектора, 40 мкг HER2-WT или 40 мкг HER2-LAMP с двумя гомологичными бустерами, введенными через 7 и 14 дней после начальной вакцинации.ELISPOT и ELISA проводили через 7 дней после последней вакцинации. (F) ELISPOT, детектирующий HER2-специфический ответ IFNγ в спленоцитах вакцинированных мышей BALB / c, n = 6 (G) ELISA, детектирующий продукцию HER2-специфических антител в сыворотке BALB / cvaccinated мышей. n = 6 (H) Продукция IFNγ и TNFα в CD8 + клетках вакцинированных мышей BALB / c, n = 6. CD8 +. Т-клетки были привязаны к клеткам CD45 + CD3 + CD8 +. (I) Продукция IFNγ и TNFα в CD4 + клетках вакцинированных мышей BALB / c, n = 6. CD4 + Т-клетки были привязаны к CD45 + CD3 + CD4 + клеткам.ECD / ICD, внеклеточные и внутриклеточные домены; HER2, рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; IFNγ, интерферон-γ; LAMP, мембрана, ассоциированная с лизосомами; OVA, овальбумин; TNFα, фактор некроза опухоли α. ANOVA. * р <0,05, ** р <0,01.

Важность презентации как MHC класса I, так и класса II в генерации антиген-специфических Т-клеточных ответов от ламповых векторов

in vitro и in vivo

Как показывают наши данные, трафик LAMP может увеличивать количество и качество CD8 + Т-клеток ответов, мы затем проверили, были ли эти события потенциально вызваны ранней активацией CD8 + и CD4 + хелперных Т-клеток.Чтобы определить активацию Т-клеток в этой системе, мы вводили ограниченное количество конгенных CD8 + OTI, ограниченных классом I, и CD4 + OTII-клеток, ограниченных классом II (меченных сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CSFE)), мышам C57BL / 6, а затем вакцинировали мышей. с векторами OVA-WT и OVA-LAMP с использованием внутрикожной электропорации (рисунок 3A). Используя эту стратегию, мы изолировали дренирующие лимфатические узлы на ранней стадии (3 дня после вакцинации), чтобы оценить, как эти вакцины повлияли на раннюю экспансию (CSFE ^до) и активацию (CD44 ^hi) OVA-специфических Т-клеток.Эти эксперименты выявили большее количество активированных и разросшихся клеток CD4 + OTII в результате вакцинации OVA-LAMP по сравнению с контрольной вакцинацией OVA-WT (рис. 3B – C). Это предполагает, что измененный трафик OVA в сигнальных клетках ведет к усиленной стимуляции Т-клеток, предположительно за счет усиленного представления класса II.

Рисунок 3

Антиген-специфический ответ Т-клеток, вызванный LAMP-опосредованным процессингом антигена через пути презентации антигена MHCI или MHCII. Спленоциты OTI или OTII CD45.2 переносили в CD45.1 реципиентная мышь. Мышей-реципиентов вакцинировали посредством внутрикожной электропорации HER2-WT или HER2-LAMP. Т-клетки анализировали с помощью FACS из дренирующих лимфатических узлов (DLN) через 3 дня после вакцинации. (B) Проточно-цитометрический анализ общего количества клеток OTII (привязанных к CD45.2 + CD3 + и CD4 +) в DLN, n = 14 (C) Кривая гибели клеток E0771-OTI / OTII, совместно культивируемых со спленоцитами OTI, n = 4 (D) ELISA, обнаруживающий секрецию IFNγ в супернатант клеток E0771-OTI / OTII, совместно культивируемых со спленоцитами OTI, n = 4 (E) MHCI — / — или MHCII — / — мышей вакцинировали посредством внутримышечной электропорации 20 мкг HER2-LAMP с 2 гомологичные повторные вакцинации вводятся через 7 и 14 дней после первоначальной вакцинации.ELISPOT и ELISA проводили через 7 дней после последней вакцинации. (F) ELISPOT, обнаруживающий HER2-специфический ответ IFNγ в спленоцитах вакцинированных контрольных мышей C57BL / 6, n = 22, MHCI — / — n = 11 или MHCII — / — n = 11 мышей. HER2, рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; IFNγ, интерферон-γ; LAMP, мембрана, ассоциированная с лизосомами; OVA, овальбумин; EGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; LUC, люцифераза. ANOVA. * р <0,05, ** р <0,01.

В то время как предыдущие исследования документально подтвердили перенос LAMP для усиления презентации пептидов класса II, 11–13 23 мы хотели определить, может ли LAMP также напрямую изменять презентацию пептидов класса I.Чтобы определить презентацию класса I, мы проверили способность LAMP или контрольных векторов представлять пептиды SIINFEKL OTI-специфическим Т-клеткам из непрофессиональных антигенпредставляющих опухолевых клеток. Мы стабильно трансдуцировали клетки E0771 (линия C57BL / 6 BC) лентивирусными векторами OTI / II-EGFP или OTI / II-EGFP-LAMP и проводили совместные эксперименты с T-клетками OTI CD8 +. Как и раньше, мы обнаружили, что OTI / II-EGFP имел значительно повышенную экспрессию EGFP по сравнению с OTI / II-EGFP-LAMP (онлайн-дополнительный рисунок S3).Несмотря на эту разницу в экспрессии, эксперименты по сокультивированию OTI CD8 + Т-клеток продемонстрировали значительно больший лизис клеток, экспрессирующих OTI / II-EGFP-LAMP, по сравнению с контролем, что согласуется с улучшенной презентацией SIINFEKL через путь класса I (фигура 3C). Примечательно, что мы также наблюдали повышенную секрецию IFNγ из этих Т-клеток, аналогичную тому, что мы наблюдали с помощью ELISPOT у вакцинированных мышей (фигура 3D). Эти исследования показали, что повышенная презентация класса I также может играть ключевую роль в эффективности вакцины на основе LAMP.Чтобы формально проверить влияние путей класса I и класса II на эффективность вакцины HER2-LAMP, мы вакцинировали мышей с дефицитом путей презентации класса I (βM KO) и класса II (MHCII KO) с помощью HER2-LAMP по сравнению с контролем дикого типа. (рисунок 3E). Эти эксперименты продемонстрировали умеренное, хотя и значительное снижение HER2-специфических Т-клеточных ответов у мышей MHCI KO, но устраняли HER2-специфические Т-клеточные и В-клеточные ответы у мышей MHCII KO (фигура 3F). Это указывает на то, что оба пути играют роль в индукции HER2-LAMP адаптивных Т-клеточных ответов, но что презентация HER2-LAMP через путь MHC класса II важна для HER2-специфических Т-клеточных ответов.

Эффективность HER2-LAMP зависит как от CD4 +, так и от CD8 + Т-клеток и обеспечивает повышенную выживаемость в модели HER2 + BC

Продемонстрировав усиление индукции антиген-специфического Т-клеточного иммунитета, мы затем хотели оценить, может ли вакцинация HER2-LAMP быть эффективную терапию против HER2 + BC in vivo и определить, зависели ли эти ответы от CD8 + или CD4 + Т-клеток. Чтобы проверить это, мы ортотопически имплантировали клетки TSA, экспрессирующие HER2 дикого типа, в жировую подушку молочной железы мышей BALB / c и вакцинировали электропорацией плазмиды HER2-LAMP через 1 день после имплантации (фигура 4A).Чтобы определить эффект CD8 + и CD4 + Т-клеток, мы вводили контрольные антитела, истощающие CD8 или CD4, перед имплантацией опухоли, поддерживая режим истощения на протяжении всего эксперимента. Эти исследования показали, что элиминация CD8 + Т-клеток отменяет все противоопухолевые ответы на вакцинацию HER2-LAMP (рис. 4B – C), предполагая, что эффективность вакцинации HER2-LAMP напрямую опосредуется CD8 + T-клетками. Кроме того, мы обнаружили, что истощение CD4 + T-клеток устраняет противоопухолевый эффект вакцины HER2-LAMP (рис. 4D – E), предполагая, что эффективность вакцинации HER2-LAMP также напрямую опосредуется CD4 + T-клетками.Чтобы выяснить, имеют ли CD4 + Т-клетки решающее значение для индукции вакцинных ответов HER2-LAMP, мы вводили контрольные или истощающие CD4 антитела перед вакцинацией и провокацией опухоли TSA-HER2 (рисунок 4F, дополнительный рисунок S4 онлайн). Эти исследования показали, что рост опухоли только частично подавлялся вакциной HER2-LAMP после истощения CD4, что указывает на то, что CD4 + Т-клетки играют важную роль в фазе индукции иммунного ответа (рисунок 4G). Как и у мышей, не несущих опухоль, мы снова наблюдали, что вакцинация HER2-LAMP значительно увеличивала активацию CD8 + HER2-специфических Т-клеток, которые ассоциировались с противоопухолевыми ответами (онлайн-дополнительный рисунок S5A-C), но не процент системно активированных CD4 + Т-клетки (онлайн-дополнительный рисунок S5D).Чтобы изучить роль CD4 + Т-клеток в эффекторной фазе противоопухолевых ответов, индуцированных вакциной HER2-LAMP, мы вводили контрольные или истощающие CD4 антитела после вакцинации и контрольного заражения опухолью TSA-HER2 (фиг. 4F). Эти исследования снова показали, что истощение CD4 на этой фазе не оказывает значительного влияния на противоопухолевые ответы, опосредованные HER2-LAMP. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что CD4 + Т-клетки выполняют важную функцию в фазе индукции, но не в эффекторной фазе противоопухолевого иммунитета, управляемого вакциной HER2-LAMP.

Рисунок 4

Вакцинация HER2-LAMP подавляет рост опухоли CD4- и CD8-зависимым образом. (A) Мышам BALB / c вводили антитела против CD4 или CD8 для истощения их соответствующих популяций на протяжении всего эксперимента с последующей имплантацией 200000 клеток TSA-HER2 в жировую подушку молочной железы. Внутрикожную электропорацию проводили с использованием 40 мкг контрольного вектора или 40 мкг HER2-LAMP с двумя гомологичными бустерами, вводимыми через 1, 7 и 14 дней после трансплантации. (B) Рост опухоли мышей, вакцинированных HER2-LAMP, мышей, имплантированных TSA-HER2, во время лечения изотипом контроля CD8, n = 6 (C) Рост опухоли мышей, вакцинированных HER2-LAMP, мышей, имплантированных TSA-HER2, во время истощения CD8, n = 6 (D ) Рост опухоли мышей, вакцинированных HER2-LAMP, мышей, имплантированных TSA-HER2, во время лечения изотипом контроля CD4, n = 6 (E) Рост опухоли мышей, вакцинированных HER2-LAMP, мышей, имплантированных TSA-HER2, во время истощения CD4, n = 3 (F) BALB / c мышам вводили имплантированные 200000 клеток TSA-HER2 в жировую подушку молочной железы и дважды вакцинировали посредством внутрикожной электропорации 20 мкг HER2-LAMP.Анти-CD4-истощающие антитела вводили до вакцинации (индукционная модель) или после имплантации (эффекторная модель). (G) Рост опухоли мышей, вакцинированных HER2-LAMP, в индукционной модели. n = 7 (H) Рост опухоли мышей, вакцинированных HER2-LAMP, в эффекторной модели. п = 7. HER2, рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; LAMP, мембрана, связанная с лизосомами. ANOVA. * р <0,05, ** р <0,01.

Вакцинация HER2-LAMP увеличивает выживаемость как на ранней, так и на поздней стадии РМЖ с HER2 +, потенциально опосредованной усиленной активацией CD4 + и CD8 + Т-клеток в микроокружении опухоли (TME).

Продемонстрировав противоопухолевый эффект вакцинации HER2-LAMP, зависящий от CD4 + и CD8 + Т-клеток, мы затем хотели проверить, может ли HER2-LAMP обеспечить более высокую противоопухолевую эффективность по сравнению с вакциной HER2-WT. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали эндогенную модель HER2 + BC, которая толерантна к HER2, зависит от экспрессии / передачи сигналов HER2 (в отличие от TSA-HER235 и развивает метастатический HER2 + BC (примерно 90% мышей несут метастазы в легкие), устойчивая к позднему этап терапевтических модальностей (T-DM1).27 Эта модель позволила нам протестировать эффективность вакцин в разные моменты времени при развитии спонтанного HER2 + BC. Чтобы проверить влияние вакцин на раннюю стадию HER2 + BC, HER2Δ16 был индуцирован введением доксициклина, и мышей вакцинировали через 1 неделю после индукции для моделирования ответов HER2 против развития HER2 + BC (фигура 5A). Важно отметить, что в этой модели вакцины HER2-WT и HER2-LAMP преодолели толерантность к HER2 и индуцировали HER2-специфические системные Т-клеточные и В-клеточные ответы (рис. 5B – C), причем тенденция Т-клеточных и В-клеточных ответов была выше в HER2. -LAMP вакцинированные мыши.Поразительно, но мыши, вакцинированные HER2-LAMP, показали значительное преимущество в выживаемости по сравнению с мышами, вакцинированными HER2-WT (фигура 5D). Примечательно, что вакцинированные HER2-LAMP мыши, свободные от опухоли, демонстрировали аналогичные HER2-специфические системные Т-клеточные и В-клеточные ответы по сравнению с вакцинированными мышами с опухолью (онлайн-дополнительный рисунок S6A). Это предполагает, что разница в выживаемости может быть опосредована измененным переносом и активацией Т-клеток в TME.

Рисунок 5

Ранняя и поздняя терапевтическая вакцинация HER2-LAMP на модели спонтанного HER2 + рака груди.(A) Мышей HER2Δ16 вакцинировали посредством внутримышечной электропорации 20 мкг OVA-LAMP (контроль) n = 7, 20 мкг HER-WT n = 9 или 20 мкг HER2-LAMP n = 11 через 7 дней после индукции доксициклином. Две гомологичные повторные вакцинации вводили через 7 и 14 дней после первоначальной вакцинации. (B) ELISPOT для обнаружения HER2-специфической продукции IFN-γ в спленоцитах мышей, вакцинированных HER2Δ16, в ранней терапевтической модели. (C) ELISA на основе клеток для обнаружения HER2-специфических антител в сыворотке мышей, вакцинированныхHER2Δ16, в ранней терапевтической модели.(D) Кривая выживаемости мышей, вакцинированных HER2Δ16, в ранней терапевтической модели. (E) Мышей HER2Δ16 вакцинировали посредством внутримышечной электропорации 20 мкг OVA-LAMP (контроль) n = 6, 20 мкг HER-WT n = 10 или 20 мкг HER2-LAMP n = 10, через 28 дней после индукции доксициклина при обнаружение самой ранней пальпируемой опухоли. Две гомологичные повторные вакцинации вводили через 7 и 14 дней после первоначальной вакцинации. (F) ELISPOT для обнаружения HER2-специфической продукции IFN-γ в спленоцитах мышей, вакцинированных HER2Δ16, в поздней терапевтической модели.(G) ELISA на основе клеток для обнаружения HER2-специфических антител в сыворотке мышей, вакцинированных HER2Δ16, в поздней терапевтической модели. (H) Кривая выживаемости мышей, вакцинированных HER2Δ16, в поздней терапевтической модели. ECD / ICD, внеклеточные и внутриклеточные домены; HER2, рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; IFNγ, интерферон-γ; LAMP, мембрана, ассоциированная с лизосомами; OVA, овальбумин. ANOVA. * р <0,05, ** р <0,01.

Поскольку наши прошлые исследования и исследования других показали, что установленные TME обладают высокой иммуносупрессивностью, 36–39 мы затем хотели проверить потенциал вакцин HER2-LAMP в более устоявшихся опухолях.Воспользовавшись нашей эндогенной моделью, мы снова выявили экспрессию HER2Δ16 с использованием доксициклина, но не начали вакцинацию, пока первая опухоль не достигла объема ~ 100 мм ³ (фигура 5E). В это время мышей с опухолью случайным образом включали в группы лечения вакциной контрольной вакциной (OVA-LAMP), плазмидной вакциной HER2-WT или HER2-LAMP. Как и раньше, мы обнаружили, что HER2-специфические Т-клеточные ответы присутствовали у всех мышей, вакцинированных HER2 (рис. 5F – G), но не различались между группами вакцины или между животными без опухолей и животными с опухолями (рис. 6B).Однако мы снова обнаружили, что мыши, вакцинированные HER2-LAMP, продемонстрировали значительное преимущество в выживаемости по сравнению с мышами, вакцинированными HER2-WT, даже у мышей с пальпируемыми опухолями (рис. 5H), что означает, что HER2-LAMP является эффективной вакциной при введении в качестве вакцины. терапевтическое средство при установленном заболевании HER2 +. В совокупности системные ответы в эти более поздние моменты времени (~ 9-30 недель после вакцинации) не различались между когортами HER2-WT и HER2-LAMP, что позволяет предположить, что различия в Т-клетках, вызванных HER2-LAMP, могут возникать после ранней индукции ответы и их первоначальное проникновение в эти гетерогенные TME.

Рисунок 6

HER2-LAMP изменяет инфильтрацию опухоли и микросреду в ортотопической модели. (A) Мышам BALB / c имплантировали 100000 клеток TSA-HER2 в жировую подушку молочной железы. Внутрикожную электропорацию проводили с использованием 40 мкг контрольного вектора n = 10, 40 мкг HER2-WT n = 9 или 40 мкг HER2-LAMP n = 8 с двумя иммунизациями, вводимыми через 3 и 10 дней после трансплантации. Анализы FACS на TILS проводили через 7 дней после последней вакцинации. (B) Количество CD8 + лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, выделенных из опухолей вакцинированных мышей.(C) Количество CD4 + лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, выделенных из опухолей вакцинированных мышей. (D) Экспрессия IFNg, Gzmb и Cxcl10 в опухолях вакцинированных мышей, как определено с помощью qRT-PCR. n = 4–7 (E) Общее количество инфильтратов CD8 +, CD4 + (F) и CD44 + / CD8 + Т-клеток в опухолях мышей, вакцинированных HER2-LAMP, используемых в модели индукции. n = 5–7. HER2, рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; IFNγ, интерферон-γ; LAMP, мембрана, связанная с лизосомами. ANOVA. * р <0,05, ** р <0,01.

Поскольку наши данные указывают на потенциальные различия в подмножестве эндогенных опухолей, которые регрессировали после вакцинации HER2-LAMP, мы решили проверить инфильтрацию Т-клеток в более ранние моменты после вакцинации на более однородной ортотопической модели TSA-HER2.Мышам имплантировали опухоли и вакцинировали контрольными векторами, HER2-WT или HER2-LAMP (на 3-й и 10-й день) перед умерщвлением на 17-й день для оценки потенциальных различий в инфильтрирующих Т-клетках (фигура 6А). Мы обнаружили, что, хотя обе вакцины значительно увеличивали инфильтрацию CD8 + и CD4 + Т-лимфоцитов, HER2-LAMP вызывал значительно большее количество CD44 + CD4 + Т-клеток по сравнению с вакцинацией HER2-WT (рисунок 6B – C). Более того, опухоли от мышей, вакцинированных HER2-LAMP, экспрессировали более высокие уровни эффекторных генов Т-клеток, таких как Ifng и Gzmb , а также хемокина для переноса Т-клеток Cxcl10 , по сравнению с контрольными HER2-WT (фигура 6D. ).Чтобы определить, были ли эти индукции следствием усиленной «помощи» CD4 + Т-клеток во время фазы индукции, мы оценили инфильтраты опухолей у мышей, у которых до вакцинации было истощено CD4, вместе с соответствующими контрольными объектами (рис. 4F – G). Эти оценки показали, что вакцинация HER2-LAMP значительно увеличила количество общих инфильтрирующих опухоль CD8 + и CD4 + Т-клеток (рисунок 6E – F), а также CD44 / CD8 + Т-клеток в опухолях по сравнению с контрольными мышами (рисунок 6G). Примечательно, что истощение CD4 + T-клеток во время фазы индукции уменьшало инфильтрацию CD8 + T-клеток, а также CD4 + T-клеток в опухолях мышей, вакцинированных HER2-LAMP (рис. 6E – F).Кроме того, мы подтвердили повышенную экспрессию IFNγ, Granzyme B, CXCL9 и CCL3 с помощью qRT-PCR в этих образцах (онлайн-дополнительный рисунок S7A – D). В соответствии с этими наблюдениями, вакцинация HER2-LAMP в отдельной серии экспериментов с использованием ортотопической модели TSA-HER2 (онлайн-дополнительный рисунок S7E) также вызвала Ifng и Gzmb , а также Ccl3 , Cxcl9 и . Cxcl10 по сравнению с контролями HER2-WT (дополнительный онлайн-рисунок S7F – J).В совокупности эти исследования предполагают, что перенос LAMP вызывает устойчивую активацию и экспансию антиген-специфических Т-клеток, частично зависимых от CD4 + Т-клеток в фазе индукции вакцинации, что может обеспечить преимущество противоопухолевой выживаемости в TME.

Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили, что конъюгация различных антигенов с LAMP приводит к усиленному перемещению в эндолизосомные субклеточные компартменты, что связано со значительным снижением уровней экспрессии белка для нескольких антигенов и в нескольких типах клеток (рис. S1).Однако, несмотря на снижение общей экспрессии антигена, вакцины HER2-LAMP позволяли усиливать антиген-специфические Т-клеточные ответы на эпитопы HER2 (включая домены ECD и ICD) по сравнению с контрольными векторами HER2 in vivo . Эти усиленные ответы не изменялись различными типами стратегий плазмидной вакцинации (внутримышечной или внутрикожной) и приводили к большему количеству полифункциональных HER2-специфичных эффекторных Т-клеток CD8 + с помощью вакцин HER2-LAMP по сравнению с вакцинами HER2-WT.Исследования инфекционных заболеваний показали, что вакцины, способные вызывать полифункциональные Т-клеточные ответы, очень эффективны, что, как показали новые иммуноонкологические исследования, также может иметь решающее значение для эффективного противоопухолевого иммунитета.40–45 Изучить, как трафик LAMP может вызывать эти усиленные ответов, мы сосредоточились на потенциальных различиях в представлении MHC классов I и II и, как следствие, активации CD4 + и CD8 + Т-клеток.

Предыдущие исследования продемонстрировали, что векторы LAMP могут усиливать презентацию MHC класса II и ответы CD4 + Т-клеток, 13 22–24 30 46, что мы также наблюдаем через усиленную активацию OTII-специфических CD4 + Т-клеток после вакцинации OVA-LAMP по сравнению с OVA -WT вакцинация (рисунок 3B).Используя мышей MHCII KO, мы также обнаружили, что вакцинная презентация HER2-LAMP эпитопов HER2 через MHC класса II была важна для индуцированных HER2-специфических Т-клеточных ответов, что предполагает критическую роль презентации MHCII в HER2-LAMP-вакцине-индуцированном HER2-специфическом иммунитете. . Этот эффект был подтвержден в экспериментах по истощению Т-лимфоцитов, которые показали, что CD4 + Т-клетки играют важную роль в опосредовании противоопухолевого иммунитета HER2-LAMP в индукции иммунных ответов от вакцинации HER2-LAMP, но не в эффекторной противоопухолевой фазе (рисунок 4).Кроме того, наши исследования также отметили прямое усиление презентации MHC класса I за счет усиленной стимуляции и прямого лизиса опухолевых клеток, экспрессирующих OTI / II-EGFP-LAMP, OTI CD8 + T-клетками in vitro , а также усиленное размножение и активацию OTI. Т-клетки после вакцинации OVA-LAMP по сравнению с вакцинацией OVA-WT in vivo . Хотя использование мышей MHCI KO продемонстрировало подавленные HER2-специфические Т-клеточные ответы после вакцинации HER2-LAMP, мы обнаружили, что CD8 + Т-клетки необходимы для противоопухолевых иммунных ответов HER2-LAMP.Эти данные, наряду с нашими открытиями MHCII, предполагают, что HER2-LAMP усиливает презентацию и стимулирует прямую активацию CD8 + Т-клеток, но также усиливает презентацию MHCII, чтобы более эффективно активировать CD4 + Т-клетки. В комбинации усиленная активация путей класса I и II генерирует превосходные полифункциональные ответы Т-лимфоцитов CD8 +, которые способны более эффективно проникать в TME (потенциально за счет повышенной секреции хемокинов) и вызывать опухолеспецифическое уничтожение. Наши исследования истощения показывают, что CD8 + Т-клетки являются доминирующими эффекторными клетками противоопухолевых ответов вакцины HER2-LAMP, причем HER2-специфические антитела играют второстепенную роль в наблюдаемых противоопухолевых ответах.

Возможно, наиболее важно то, что наши исследования также продемонстрировали, что вакцинация HER2-LAMP вызывает долгосрочную выживаемость и полную регрессию опухоли у ~ 30% мышей после ранней и поздней вакцинации в агрессивной и устойчивой к таргетной терапии эндогенной модели HER2 + BC. Этот результат был поразительным, поскольку наши предыдущие исследования продемонстрировали большую сложность иммунотерапевтических стратегий для выработки лечебного иммунитета при запущенных формах рака.6 7 39 47 Примечательно, что все вакцинированные мыши продемонстрировали значительную системную индукцию HER2-специфических Т-клеточных и В-клеточных ответов после вакцинации, которые было сходным у мышей, у которых не было опухоли, и у мышей с прогрессирующим заболеванием HER2 +.Это предполагает, что различия в индуцированном вакциной противоопухолевом иммунитете могут быть связаны с ранними различиями в индукции иммунитета, которые трансформируются в различия в TME. Используя ортотопическую модель, которая позволила нам исследовать опухоли на более раннем этапе после вакцинации, мы подтвердили, что вакцинация HER2-LAMP индуцирует более активированные популяции CD8 + и CD4 + Т-клеток в TME, а также более высокую экспрессию IFNγ, гранзима B и различных хемокинов. Эти инфильтраты CD8 + T-клеток в TME подавлялись истощением CD4 + T-клеток во время вакцинации HER2-LAMP.Это снова предполагает, что усиленный HER2-LAMP противоопухолевый иммунитет и повышенная выживаемость могут быть связаны с более мощной активацией хелперов и последующей активацией эффекторных Т-клеток, которые индуцируют эффекторные гены и рекрутируют профили хемокинов, которые могут вызывать регрессию опухоли в значительная доля раковых заболеваний. Эта частота ответа аналогична той, которая наблюдается при многих видах рака при блокаде иммунных контрольных точек PD-1 / PD-L1, когда ~ 20% мышей реагируют на лечение. Примечательно, что мы обнаружили, что использование PD-1 mAb в этой модели приводит к 100% смертности к 18 неделям (Crosby et al , Clinical Cancer Research (CCR) в обзоре).Это говорит о том, что вакцинация HER2-LAMP может предложить убедительный подход к выработке противоопухолевого иммунитета при агрессивных формах рака с низким уровнем неоэпитопов.

В совокупности эти результаты предполагают, что векторы, нацеленные на LAMP, обеспечивают усиленное нацеливание на эндолизосомный антиген, что ускоряет усиленную презентацию MHC классов I и II. Это улучшенное представление приводит к большей активации как CD4 +, так и CD8 + Т-клеточного ответа, полифункциональных CD8 + Т-клеток и, в конечном итоге, отторжения опухоли и долгосрочного выживания у подгруппы мышей.Это отражает доклинические и клинические исследования различных видов иммунотерапии при РМЖ, которые демонстрируют гетерогенную регрессию опухоли, связанную с различиями в инфильтрации Т-лимфоцитов и местной иммуносупрессии. 39, 48 49 Наши клинические исследования показывают, что стимуляция HER2-специфических CD8 + Т-клеток памяти является важным требованием. для выживаемости без прогрессирования заболевания 6 использование HER2-LAMP-вакцин может иметь значительное влияние на устойчивый к лечению метастатический HER2 + BC. Учитывая, что эффективная местная иммуносупрессия может по-прежнему ограничивать эти ответы у значительной части мышей, вакцины HER2-LAMP можно эффективно сочетать с гетерологичными вакцинами (такими как наши вирусные векторы HER2) для дальнейшего усиления иммунных ответов против HER2 или с PD-1. / Ингибиторы иммунных контрольных точек PD-L1 для уравновешивания местной иммуносупрессии, которые находятся в центре внимания наших продолжающихся исследований.Кроме того, способность вызывать мощный противоопухолевый иммунитет против аутоантигенов предполагает, что эта стратегия может быть высокоэффективной в создании противоопухолевых ответов. Действительно, в нескольких исследованиях было высказано предположение, что нацеливание на LAMP обеспечивает более эффективные иммунные ответы, специфичные для HPV E6 / E7, а также для усиления противоопухолевого иммунитета против рака, связанного с HPV.